2020—2021年河北省部分地区副猪嗜血杆菌流行情况调查及耐药性分析
王福厚，黄冬青，葛生虎
（1.甘肃畜牧工程职业技术学院，甘肃 武威 733006；
2.临西县农业农村局，河北 邢台 054900；
3.河北铭诸生物科技有限公司，河北 邢台 054000）
副猪嗜血杆菌病又名多发性纤维素性浆膜炎，是由副猪嗜血杆菌（Hps）感染引起的一种常见细菌性疾病。Hps广泛存在于猪场，该菌一般定殖于猪上呼吸道，健康猪群感染该菌不会表现严重的临床症状。若猪群免疫能力下降，Hps感染则会导致病猪出现关节炎、支气管肺炎和脑膜炎等，继而给猪场造成严重的经济损失[1]。
Hps可感染不同发育阶段猪群，但2周至4月龄猪群对该病原更易感，且发病率和死亡率较高。截至目前，全世界流行的Hps菌株可分为21个血清型，不同血清型之间免疫力较差，且毒力也存在很大的差别[2]。此外，目前对于副猪嗜血杆菌病的防治主要依赖于抗生素的使用，而抗生素的滥用或不合理使用导致猪场Hps耐药株频繁出现，这给该病的防治造成了巨大的困难。谭美芳等[3]发现大部分Hps江西分离株对氨基糖苷类、大环内酯类和氨苄西林等抗生素耐药性较高，甚至部分菌株出现多重耐药现象；
王庆云[4]调查结果发现，大部分Hps安阳分离株对青霉素、阿莫西林、红霉素和多黏菌素等抗生素耐药，对环丙沙星、头孢噻肟和头孢噻呋等抗生素较敏感。由此可见，有效防治副猪嗜血杆菌病的前提是筛选对菌株敏感的抗生素，以免造成抗生素滥用。
为初步了解近年来河北省部分地区猪场Hps流行情况，本研究于2020—2021年从河北邢台及周边地区猪场采集组织病料共2 844份，通过荧光定量PCR法确定检测样品Hps阳性率；
分离获得部分菌株进行药敏试验，旨在为该病的临床用药提供科学依据。
1.1 样品来源
于2020年1月至2021年12月从河北邢台、保定、邯郸、秦皇岛、张家口和石家庄等地区的664个猪场采集疑似感染副猪嗜血杆菌组织样品2 844份。由猪场兽医或其他工作人员剖检病猪后，取少量组织样品（肺脏）装入洁净封口袋内，低温送至河北铭诸生物科技有限公司，待检。
1.2 样品处理及病原检测
在无菌条件下，切取少量组织样品剪碎后置于2 mL离心管内，加入少量无菌PBS和钢珠，置于匀浆机内高速匀浆。将混合物以13 000 r/min离心5 min，取200 μL上清液用于DNA基因组提取（试剂盒为武汉科前生物股份有限公司产品），最后获得的核酸保存于-20 ℃或立即用于荧光定量PCR检测。
采用Hps特异性引物，利用商业化荧光定量PCR试剂盒（湖南冠牧生物科技有限公司产品）检测待检组织样品中是否存在Hps核酸，每次检测均设置阳性对照和阴性对照。反应结束后，根据样品对应CT值判定其是否为阳性，若样品CT值低于35则判定为阳性，若CT值大于35则判定为阴性。
1.3 细菌分离及革兰氏染色鉴定
取少量Hps核酸阳性样品对应组织上清液，用灭菌接种环蘸取上清液后在含10%乳牛血清的TSA固体培养基平板表面划线，其后将平板放置于37 ℃恒温箱内培养24～36 h。挑取单一菌落进行革兰氏染色鉴定，参考相关文献[5]判定分离菌株是否为Hps。
1.4 药敏试验
将革兰氏染色鉴定为Hps阳性的菌株进行扩增，其后将菌液梯度稀释至106cfu/mL，每个平板均匀涂布100 μL稀释液。将平板于37 ℃恒温箱内放置10 min使其表面稍干，向平板贴上含有不同抗生素的药敏纸片（共12种），每个平板贴4种纸片。将贴加药敏纸片的平板放置于37 ℃恒温培养箱中培养16～24 h，然后使用游标卡尺计算各药敏纸片的抑菌圈大小，依据抑菌圈直径来初步判断该菌株对纸片对应抗生素是否具有耐药性。
2.1 河北省不同地区临床样品Hps检测结果
结果发现：共371个猪场的887份样品检测为Hps阳性，场阳性率和样品阳性率分别为55.87%和31.19%；
其中2020年和2021年送检样品猪场场阳性率分别为60.20%和49.03%，样品阳性率分别为37.97%和21.69%。进一步统计发现不同地区场阳性率为49.48%～62.50%，样品阳性率为19.94%～56.58%。详见表1。
表1 河北省不同年份和地区临床样品Hps检测结果
2.2 河北省不同季节及发育阶段猪群Hps检测情况
为进一步分析不同季节来源组织样品Hps检测情况，本研究于春季、夏季、秋季和冬季采集样品数量分别为650份、906份、841份和447份，其中阳性样品数量分别为146份、348份、271份和122份，阳性率分别为22.46%、38.41%、32.22%和27.29%；
对于不同发育阶段猪群而言，仔猪群Hps阳性率最低，为16.43%（34/207），而后备母猪和经产母猪群Hps阳性率相对较高，分别为50.62%（244/482）和57.24%（257/449）。详见表2。
表2 河北省不同季节及发育阶段猪群Hps检测情况
2.3 细菌分离及药敏试验
随机从不同地区选择34份Hps阳性样品用于细菌分离鉴定，将组织样品处理后取上清液于TSA平板上进行划线。培养24 h后可见平板划线出现针尖状透明菌落，为露珠状；
取单一菌落进行革兰氏染色，可见阴性、有荚膜的杆菌，可鉴定为Hps。
对分离获得的34株Hps分离株进行药敏试验，结果如表3所示：大部分Hps分离株对青霉素、卡那霉素和复方新诺明耐药，其耐药率分别为79.41%、61.76%和79.41%；
所有分离株对头孢噻肟敏感，大部分菌株对头孢曲松、氟苯尼考、米诺沙星和阿米卡星敏感，比例分别为91.18%、88.24%、85.29%和55.88%。
表3 Hps分离菌株药敏试验统计结果 株
近年来，国内生猪养殖逐渐由散养、小规模养殖向集约化、规模化养殖转变；
生猪养殖模式的改变导致多种疾病频发，其中包括副猪嗜血杆菌病。Hps是猪呼吸道的常见菌，一般情况下感染Hps的猪群不会出现严重的临床症状，这也在一定程度上导致Hps在猪场广泛流行。若猪群免疫力下降，Hps感染则可导致病猪出现严重的临床症状，如关节炎和脑膜炎等，因此Hps的流行严重危害我国养猪业的健康发展。此外，对于副猪嗜血杆菌病的防治主要依赖于抗菌药的使用，但抗菌药的不合理使用会导致多重耐药Hps菌株出现，这不利于猪场副猪嗜血杆菌病的防控。因此，了解猪场副猪嗜血杆菌的流行及耐药情况对该病的综合防制意义重大。
本研究于2020—2021年调查了河北省部分地区猪场副猪嗜血杆菌流行情况和分离株耐药情况。结果发现664个猪场共2 844份组织样品中有371个猪场的877份样品为Hps阳性，其场阳性率和样品阳性率分别为55.87%和31.19%，其中不同地区样品阳性率19.94%～56.58%。赵美雪等于2017—2018年调查了河南省不同地区1 060份无害化场病料Hps阳性率，发现该地区病料群体阳性率和样品阳性率分别为69.78%和35.94%[6]；
周政等调查结果发现湖南省湘潭县健康猪群Hps隐性感染率为22.5%（27/120）[2]。以上结果表明，Hps在我国猪群流行情况十分严重，需要引起养猪企业（户）的重视。进一步分析发现2020年和2021年河北省部分地区Hps检出率分别为37.97%和21.69%，养殖场为防控非洲猪瘟而提高了猪场生物安全水平，这在一定程度上也抑制了Hps的流行。此外，对于不同发育阶段猪群而言，我们发现Hps检出率与猪群年龄呈一定的正相关性，这与李天艳等调查结果一致[7]。可能是由于Hps一般为隐性感染，且该病原广泛分布于猪场，故高龄猪群接触并感染Hps几率较低龄猪群更高。对于不同季节而言，我们发现春季、冬季较夏季、秋季来源样品Hps检出率低，这可能是夏季和秋季气温较高，更加有利于Hps在外界传播和感染生猪等。但总体而言，四季Hps检出率均较高，提示猪场应该重视该病的防控工作。
进一步细菌药敏试验发现，Hps分离株对不同抗生素耐药性存在差异，但大部分菌株对青霉素、卡那霉素和复方新诺明等抗生素存在耐药性，这可能与此类抗生素经常用于猪场防控细菌疾病等有关；
大部分或所有菌株对头孢曲松、氟苯尼考、米诺沙星和头孢噻肟敏感，提示此类抗菌药物是防控副猪嗜血杆菌病的首选药物。值得注意的是，本研究仅选择了12种常见抗菌药进行药敏试验，Hps分离株对其他抗菌药的耐药性还需要进一步研究。此外，Hps存在多种血清型，不同血清型Hps菌株对生猪的毒力和致病力等也存在差异，因此后续研究中还应该检测Hps分离株的血清型等。