d-α-生育酚预防仔猪肝脏急性炎症损伤的效果

赵嘉楠，任 颖，余镇东，孙海辉，甘欢华，张 斌，黄辉其，马立保

（1.华中农业大学动物科学技术学院动物医学院，湖北 武汉 430070；
2.宜春大海龟生命科学有限公司，江西 宜春 336000）

断奶是仔猪生长发育的重要阶段之一，早期断奶可以提高仔猪饲料利用率、减少被母猪压死和母猪传染仔猪疾病的机会，有利于提高仔猪成活率。但早期断奶也会使体内产生大量活性氧（ROS），引发仔猪氧化应激[1-3]，破坏机体氧化还原平衡。肝脏是仔猪代谢的主要部位，含有大量的线粒体，是机体产生活性氧的关键器官[4-5]，ROS会破坏肝脏线粒体中的DNA、阻止肝细胞呼吸链中的酶蛋白合成和细胞膜的形成，所以肝脏是氧化应激引起损伤的靶器官。此前有研究报道，断奶可能导致仔猪肝脏氧化应激，并通过MAPK信号影响肝细胞凋亡[6]。

细菌内毒素脂多糖（LPS）可引起炎症和氧化应激，造成不同器官的损伤，对动物生产能力产生不良影响[7]。有研究证实，LPS的过度积累会导致肝脏损伤[8-9]，所以LPS刺激引起的应激模型也被用作肝脏急性损伤模型。因此，我们采用LPS刺激来模拟断奶仔猪的急性肝损伤。

维生素E包含α-、β-、γ-及δ-生育酚和α-、β-、γ-及δ-生育三烯酚等多种生物形式，而d-α-生育酚是维生素E中存在最多、分布最广、生物活性最高的物质。d-α-生育酚是动物生长发育的必需营养物质，为了防止d-α-生育酚在饲料生产加工和储藏中的损失，饲料中的dl-α-生育酚均以酯的形式存在，已有的研究报道断奶仔猪更易吸收天然酚式结构的d-α-生育酚[10]。大量的研究结果表明，d-α-生育酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、心血管保护作用及脂肪沉积调控等广泛的生物学功能。但目前，d-α-生育酚的研究主要集中在畜禽生长性能、肉品质、免疫调节和抗氧化性能等方面，而对于仔猪肝脏损伤的预防作用则鲜有报道。因此，本研究拟在正常饲养条件下，模拟仔猪断奶应激导致的仔猪肝脏损伤，并在腹腔注射LPS建立仔猪急性炎症氧化应激模型，通过在饲料中加入天然酚式结构的d-α-生育酚（75 mg/kg d-α-生育酚），探究其对断奶仔猪血液生化指标、肝脏组织形态和肝功能酶的作用效果，以期为解决仔猪断奶应激导致的肝脏损伤和注射疫苗等急性炎症反应造成的急性肝损伤等健康问题提供新的治疗方案。

1.1 时间与地点

饲养试验于2021年8月中旬至9月中旬在湖北龙王畜牧有限公司养猪场开展，试验周期21 d。试验猪于2021年9月14日在湖北龙王畜牧有限公司进行屠宰测定。

1.2 试验材料

本试验使用的d-α-生育酚由米糠油提取纯化，总生育酚含量为87.58%，其中d-α-生育酚纯度为99.8%，由宜春某生命科学有限公司提供。

1.3 试验动物与设计

试验采用随机试验设计，选择21日龄、体重和胎次相近、健康状况良好的长大二元杂种断奶仔猪72头，按体重相近原则随机分为2组，每组6个重复，每个重复6头仔猪。对照组饲喂基础饲粮（简称C组），试验组饲喂基础饲粮+75 mg/kg d-α-生育酚（简称TP组），试验周期21 d。在试验第22天上午，分别从两个处理组（C组和TP组）中随机挑选6头仔猪腹腔注射脂多糖LPS溶液（100 mg/kg体重），建立氧化应激模型，分别简称为CL组和TPL组；
两个处理组（C组和TP组）中剩下的仔猪中再分别随机挑选6头仔猪注射相同剂量灭菌生理盐水作为对照，分别简称为CC组、TPC组。注射LPS溶液4 h以后，24头仔猪全部屠宰，采集血清和肝脏样品。

1.4 饲粮配制与饲养管理

基础饲粮参照仔猪的饲粮配方适当调整配制（NRC，2012），其饲粮组成及营养水平见表1。

表1 试验基础饲粮组成及营养水平

试验期间仔猪饲养在全封闭式的保育仔猪舍内，塑料漏缝地板，通风良好。试验期间自由采食和饮水，每天定时清扫猪圈和消毒，仔猪的免疫按常规程序进行，仔猪饲养管理措施严格执行卫生防疫制度。

1.5 样品采集

LPS注射4 h后，所有仔猪颈静脉放血处死。屠宰后立即收集仔猪的血清和肝脏组织样本。取1 cm左右肝脏组织块固定在4%多聚甲醛溶液中，另取几块收集于2 mL的冷冻管中，置于-80 ℃保存待用。

1.6 检测指标

1.6.1 肝脏组织病理学观察取肝组织在4%聚甲醛中4 ℃固定48 h。然后对组织块进行修整、脱水、透明、石蜡包埋，以5 µm厚度为标准进行切片、摊片和烘片。然后将切片脱蜡，用无水乙醇反复浸泡，后用蒸馏水浸泡后进行苏木精-伊红（H&E）染色。染色后脱水，用中性树胶封片备用。每组组织标本取2片，用光学显微镜观察，确定肝脏切片的组织学损伤程度。

1.6.2 血液生化指标和肝功能酶活性测定 采集每组6头猪的血清样品，用试剂盒进行血液生化指标及肝功能酶指标测定，试剂盒购自南京建成股份有限公司（中国南京）。

1.7 数据统计分析

采用SPSS 26.0对数据进行多重比较分析。结果以平均值±标准差表示。

2.1 肝脏组织病理学观察

为了探讨d-α-生育酚对肝脏的保护作用，笔者采用H&E染色法观察了肝组织的病理变化。如图2所示，CC组仔猪未见明显的炎症细胞浸润，肝细胞完整；
TPC组仔猪肝细胞结构完整清晰，细胞核位于中心，呈圆形；
CL组肝窦内白细胞增多，间质里有较多炎症细胞浸润；
TPL组仔猪有少量炎症细胞浸润，细胞形态完整。在饲粮中添加d-α-生育酚减轻了LPS诱导的炎症细胞浸润程度。

2.2 d-α-生育酚对断奶仔猪血液生化指标的影响

由表2可以看出，TPC组的血清总抗氧化能力（T-AOC）和过氧化氢酶（CAT）活性显著高于CC组（P＜0.05），丙二醛（MDA）含量显著低于CC组（P＜0.05）。用LPS处理过后，CL组的血清总抗氧化能力和过氧化氢酶活性低于CC组，且差异显著（P＜0.05），丙二醛含量显著高于CC组（P＜0.05）；
TPL组的血清总抗氧化能力、过氧化氢酶活性显著高于CL组（P＜0.05），与CC组不存在显著性差异（P＞0.05），TPL组丙二醛含量显著低于CL组（P＜0.05）。

表2 d-α-生育酚对断奶仔猪血液生化指标的影响

2.3 d-α-生育酚对断奶仔猪肝脏肝功能酶的影响

由表3可知，CL组的谷草转氨酶（AST）活性、碱性磷酸酶（ALP）活性是4个组中最高的，且分别与CC组、TPC组存在显著差异（P＜0.05），CL组的谷草转氨酶活性、碱性磷酸酶活性虽高于TPL组，但差异不显著（P＞0.05）；
各组间的谷丙转氨酶（ALT）活性无显著差异（P＞0.05）。

表3 d-α-生育酚对断奶仔猪肝功能酶的影响

早期断奶对于仔猪来说是一个心理和生理上压力很大的时期。仔猪在断奶后，营养来源、生活环境、饲养管理方式等发生改变，同时与母猪分离、注射猪瘟疫苗，这些原因都会导致仔猪发生应激反应。脂多糖（LPS）是一种细菌内毒素，大量LPS积累会引发炎症及细胞损伤[8]，可以很好地模拟仔猪遭受外界刺激后的急性应激和炎症反应。肝脏是活性氧（ROS）产生的主要部位，但幼龄时肝脏抗氧化系统发育不成熟，仔猪难以应对较严重的氧化应激[11]。因此，补充抗氧化剂成为一种可行的治疗策略，以使肝脏损伤和疾病的风险降到最低。

3.1 d-α-生育酚对断奶仔猪肝脏组织病理学的影响

在正常的生理环境中，细胞中存在许多抗氧化剂，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、维生素E等，均可以清除体内有害的自由基，使自由基的消除和产生处于动态平衡状态[12]。然而，当发生氧化应激或是其它应激时，活性氧（ROS）含量增加，超过了抗氧化剂清除ROS的最大限度，使ROS动态平衡失衡，就会导致细胞损伤。本研究中发现受断奶应激的仔猪，在断奶21 d后，应激对肝脏组织病理学形态没有显著影响，肝脏结构未见明显改变、水肿和炎症细胞浸润，有可能与断奶时间太长，仔猪自行修复了损伤有关。LPS刺激引起肝窦内白细胞增多，间质内炎症细胞浸润，出现明显的肝脏损伤。有文献表明，TLRs和NODs均是LPS的受体[13-14]，LPS刺激可诱导仔猪肝脏中TLRs（TLR4、MyD88和TRAF6）和NODs（NOD1、NOD2）mRNA和蛋白的产生以及炎症反应相关基因NF-kB、COX2、TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8的上调，而促炎细胞因子的过度产生可引起宿主肝脏损伤[13，15]，这可能是CL组肝脏组织病理学变化的主要原因。而维生素E可以有效清除体内有害的自由基，抑制ROS诱导的炎症反应，减少肝细胞被炎症细胞浸润程度，减缓肝损伤。试验中TPL组肝脏组织病理切片也证明了这一点。因此，在饲粮中添加d-α-生育酚，可以有效地改善肝损伤。Wong等在大鼠中的研究也表明维生素E的摄入减少了心脏和肝脏炎症细胞的浸润，对肥胖大鼠的代谢紊乱和肝功能损伤具有保护作用[16]。

3.2 d-α-生育酚对断奶仔猪血液生化指标的影响

酶促和非酶促抗氧化系统是细胞反应和生理条件下调节氧化应激所必需的[17-18]。过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶等抗氧化酶是评价氧化应激的指标。TPC组的CAT高于CC组，TPL组的CAT和总抗氧化能力（T-AOC）高于CL组，说明在饲粮中添加75 mg/kg d-α-生育酚可提高仔猪抗氧化酶的活性。丙二醛（MDA）是一种三碳细胞毒性分子，由多不饱和脂肪酸的过氧化作用产生[19]。血清MDA浓度作为脂质过氧化状态的标志，在之前的研究中已经报道过猪血清中丙二醛浓度会因为饲粮中抗氧化剂含量的降低而增加[20-21]。本研究中，TPC组的丙二醛含量显著低于CC组（P＜0.05），TPL组的丙二醛含量也显著低于CL组（P＜0.05），这与总抗氧化能力变化相对应。

3.3 d-α-生育酚对断奶仔猪肝功能酶的影响

谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）是主要存在于肝细胞中的重要转氨酶。正常情况下，AST、ALT、ALP存在于肝细胞内。然而，在肝损伤的情况下，这些酶会从肝细胞释放到机体循环中[22]。因此，我们测定了血浆中AST、ALT和ALP的水平，反映仔猪肝损伤和氧化应激程度。在CC组高水平的AST、ALT表示由氧化应激引起的仔猪肝功能明显受损，进一步说明了氧化应激是肝细胞功能受损的常见机制[23-24]，这与Hyder等的研究结果一致。CL组仔猪血清中AST、ALP水平显著升高，明确提示了LPS所致急性肝损伤的发生。而在饲粮中添加75 mg/kg d-α-生育酚，TPC组、TPL组分别比CC组、CL组降低了血清中ALT、AST、ALP等的含量，这与组织学观察结果一致。以上结果表明，d-α-生育酚对LPS诱导的急性肝损伤和氧化应激引起的肝脏组织和功能损伤有一定的抑制作用。在小鼠中也报道了类似的结果，Chung等[25]研究发现α-和γ-生育酚都能阻止LPS诱导的血清谷丙转氨酶（ALT）活性的增加，并通过降低血清ALT活性来减轻脂质性肝脏损伤。Abdel-Maboud等[26]对发表的15项随机对照试验进行了系统回顾和荟萃分析发现，维生素E显著降低了成人和儿童的ALT活性。但具体作用机制目前还未有研究报道，需要进一步研究。

在本试验条件下，在断奶仔猪饲粮中添加75 mg/kg d-α-生育酚提高了断奶仔猪的抗氧化能力、降低了断奶仔猪血清中肝功能酶的含量，从而改善了仔猪氧化应激引起的肝脏损伤。同时，在仔猪饲料中加入75 mg/kg d-α-生育酚，可以减少环境变化、注射疫苗等应激带来的急性肝脏损伤。

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