一测多评法同时测定丹参配方颗粒中7个酚酸类成分
邝敏，严玉晶，林嘉明，汪梅，黄醒鹏，李玲，张正（广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点试验室，广东 佛山 528244）
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根茎，性微寒，味苦，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效。临床上常用于胸痹心痛、胶腹胁痛、癥痕积聚、热痹疼痛、心烦不眠、月经不调、痛经经闭、疮疡肿痛[1]。丹参含有二萜类、三萜类、酚酸类、黄酮类及生物碱类等化合物，其中脂溶性二萜类与水溶性酚酸类化合物是丹参的主要活性成分[2]。现代研究表明，酚酸类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗高血压、抗动脉粥样硬化、保护心肌细胞和抗胃溃疡等药理作用[3-8]。
丹参配方颗粒是在中医药理论指导下，用符合药典标准的丹参饮片经现代工业水提、分离、浓缩、干燥、制粒而成的中药产品；
其性味、归经、功效与丹参饮片一致，不含糖、防腐剂和其他赋形剂。用其代替丹参饮片供临床配方使用，既保持了丹参饮片的药性药效，又具有免煎煮、易于调剂、方便服用等优点。中药有效成分复杂多样，单一指标成分评价难以准确反映中药内在质量，具有一定的局限性。而多指标质量评价模式需要的对照品种类繁多，且部分对照品存在难分离、造价高、稳定性差等问题。王智民等[9]提出的一测多评（quantitative analysis of multicomponents by single-marker，QAMS）法是利用一种相对易得、廉价的对照品作为内参物，同时实现多个同类型化合物含量测定的多指标质量控制方法。该方法克服了对照品紧缺、检测成本高等困难，适合中药多指标质量评价检测。丹参配方颗粒作为中药新剂型在现代临床被广泛使用，但目前针对丹参配方颗粒整体质量控制的研究较少。因此，本试验采用QASM法同时测定丹参配方颗粒中丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B的含量，以期为提高丹参配方颗粒整体质量控制提供参考。
Waters Arc型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；
Agilent 1290型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；
XP26型百万分之一天平、ME204E型万分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；
Milli-Q Direct型超纯水系统（德国Merck公司）；
KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
对照品原儿茶醛（批号：110810-201909，纯度：99.6%）、咖啡酸（批号：110885-201703，纯度：99.7%）、迷迭香酸（批号：111871-202007，纯度：98.1%）、丹酚酸B（批号：111562-201917，纯度：96.6%）（中国食品药品检定研究院）；
丹参素（批号：DSTDD001501，纯度：98.79%，成都乐美天医药科技有限公司）；
紫草酸（批号：wkq21031202，纯度：99.31%，四川省维克奇生物科技有限公司）；
丹酚酸E（批号：040169-202203，纯度：97.75%，上海鸿永生物科技有限公司）。甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck股份有限公司）；
磷酸为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；
水为超纯水；
其他试剂均为分析纯。12批丹参配方颗粒（编号：DS-1～DS-12）均由广东一方制药有限公司制备。
2.1 色谱条件
色谱柱：Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～15 min，10%～20%A；
15～40 min，20%～25%A；
40～50 min，25%～30%A；
50～51 min，30%～10%A；
51～56 min，10%A）；
流速：1.2 mL·min－1；
柱温：25℃；
检测波长：286 nm；
进样量：10 μL。
2.2 对照品溶液的制备
分别取丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成质量浓度分别为50.699、10.558、2.161、11.300、19.777、20.100、108.540 μg·mL－1的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取丹参配方颗粒适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇100 mL，称重，超声处理（功率140 W，频率42 kHz）30 min，取出，放冷，再称重，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 专属性试验 分别精密吸取空白溶剂、混合对照品溶液及供试品溶液（编号DS-2），按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见图1。可见，供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应的保留时间处具有相同的色谱峰，且空白溶剂无干扰，表明该方法专属性良好。
图1 专属性试验HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of specific test
2.4.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL，置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列质量浓度的混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以对照品溶液质量浓度（μg·mL－1）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果见表1。可知7个成分在相应质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。
表1 7个成分的线性关系考察结果Tab 1 Linearity of 7 components
2.4.3 精密度考察 分别精密吸取混合对照品溶液（丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B质量浓度分别为50.325、10.933、2.089、12.132、20.014、20.256、110.587 μg·mL－1）1.0、5.0、10 mL，置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成低、中、高浓度的混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件分别连续进样6次，计算色谱峰峰面积RSD，测定日内精密度；
分别连续进样6次，连续测定3 d，计算色谱峰峰面积RSD，测定日间精密度；
结果7个成分低、中、高质量浓度日内精密度RSD在0.38%～2.1%，日间精密度RSD在1.2%～3.7%，表明方法日内精密度良好。
2.4.4 稳定性试验 取丹参配方颗粒（编号DS-2），精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、24、48 h进样测定，计算得丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.43%、0.52%、1.3%、0.80%、1.2%、1.1%、0.28%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。
2.4.5 重复性试验 取丹参配方颗粒（编号DS-2），精密称定，平行6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定。计算得丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B含量的RSD分别为1.5%、0.92%、2.3%、0.59%、2.3%、1.5%、0.60%，表明方法重复性良好。
2.4.6 加样回收试验 取已知含有量的丹参配方颗粒（编号DS-2）适量，精密称取9份，每份约0.1 g，置具塞锥形瓶中，分为3组，每组分别精密加入相当于含有量50%、100%、150%的混合对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算得到丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的平均加样回收率均在97.50%～105.59%，RSD均小于5.0%，表明该方法准确度良好。
2.5 QAMS法的建立
2.5.1 相对校正因子（f）的确定 取“2.2”项下混合对照品溶液0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10 mL，置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，进样测定，以原儿茶醛作为内参物，计算丹参素、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的相对校正因子。公式为fs/i＝fs/fi＝（As/Cs）/（Ai/Ci）＝（As×Ci）/（Ai×Cs），式中As为内参物峰面积，Cs为内参物浓度，Ai为某待测成分峰面积，Ci为某待测成分浓度[10]。计算得相对校正因子，结果见表2。
表2 6个成分的相对校正因子(n＝6)Tab 2 Relative correction factors of 6 components (n＝6)
2.5.2 不同测定仪器及色谱柱对相对校正因子的影响 以原儿茶醛为内参物，考察其他6个成分在不同高效液相色谱仪Waters Arc型、Agilent 1290型，以及不同色谱柱Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Athena C18-WP（250 mm×4.6 mm，5 μm）下的相对校正因子，结果见表3，各成分的相对校正因子RSD均小于3.0%，表明不同色谱系统和色谱柱对各成分相对校正因子无显著影响。
表3 不同色谱仪和色谱柱对相对校正因子的影响(n＝3)Tab 3 Influence of instrument and column on relative correction factors (n＝3)
2.5.3 不同流速对相对校正因子的影响 以原儿茶醛为内参物，考察其他6个成分在不同流速（0.8、1.0、1.2、1.5 mL·min－1）下的相对校正因子，结果见表4，各成分的相对校正因子RSD均小于3.0%，表明不同流速对各成分相对校正因子无显著影响。
表4 不同流速对相对校正因子的影响(n＝3)Tab 4 Influence of flow rate on relative correction factors (n＝3)
2.5.4 不同柱温对相对校正因子的影响 以原儿茶醛为内参物，考察其他6个成分在不同柱温（25、30、35、40℃）下的相对校正因子，结果见表5，各成分的相对校正因子RSD均小于3.0%，表明不同柱温对各成分相对校正因子无显著影响。
表5 不同柱温对相对校正因子的影响(n＝3)Tab 5 Influence of column temperature on relative correction factors (n＝3)
2.5.5 不同进样体积对相对校正因子的影响 以原儿茶醛为内参物，考察其他6个成分在不同进样体积（5、8、10、12、15 μL）下的相对校正因子，结果见表6，各成分的相对校正因子RSD均小于5.0%，表明不同流速对各成分相对校正因子无显著影响。
表6 不同进样体积对相对校正因子的影响(n＝3)Tab 6 Influence of injection volume velocity on relative correction factors (n＝3)
2.6 待测成分色谱峰的定位
采用不同色谱仪及色谱柱测定时，待测成分的保留时间会有所波动，目前在QAMS研究中常用的色谱峰定位方法有相对保留值法、保留时间差法、时间校正法、对照提取物法等。本试验采用相对保留值法，计算公式为ti/s＝ti/ts[11-14]。以原儿茶醛为内参物，考察其他6个成分在不同高效液相色谱仪（Waters Arc型、Agilent 1290型）及不同色谱柱[Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Athena C18-WP（250 mm×4.6 mm，5 μm）]下的相对保留值，结果见表7，各成分相对保留值的RSD＜3.0%，表明不同色谱系统和色谱柱对各成分相对保留值无显著影响。
表7 不同色谱仪和色谱柱对相对保留值的影响(n＝3)Tab 7 Influence of instrument and column on relative retention time (n＝3)
2.7 外标法（ESM）和QAMS测定结果对比
取12批丹参配方颗粒适量（DS-1～DS-12），精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别采用QAMS和ESM法测定各成分含量，利用SPSS 26.0软件对两组结果进行Pearson相关系数（r）分析，结果见表8。两种方法之间的r均为1.000，两种方法计算的含量具有高相关性（P＞0.05）。使用QAMS和ESM法测定丹参配方颗粒中丹参素、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量，计算两种测定方法下的相对误差（RAD），RAD（%）＝[（QAMS计算值－ESM实测值）/外标法实测值]×100%[15]，结果显示丹参素、咖啡酸、丹酚酸E、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的相对误差范围分别为0.43%～0.53%、0.00%～3.70%、0.00%～0.34%、1.71%～2.01%、2.53%～2.93%、1.69%～1.73%，说明建立的丹参配方颗粒QAMS准确可行。
表8 6个成分的含量测定结果(n＝3，%)Tab 8 Content determination of 6 components (n＝3，%)
3.1 供试品溶液制备方法选择
本研究对供试品溶液的提取方式（超声法、回流法）、提取溶剂（水、30%甲醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇）、提取时间（20、30、40 min）进行考察。结果表明，本研究供试品制备方法操作简便，且供试品溶液色谱峰峰面积、分离度均较好。
3.2 色谱条件的选择
本研究比较了甲醇、乙腈两种有机溶剂和不同浓度的磷酸、甲酸、醋酸组合的流动相体系，发现使用乙腈作为有机相较甲醇洗脱能力强，峰分离度好，使用磷酸作为水相时色谱图基线更平稳，噪音小。乙腈-0.05%磷酸洗脱时目标峰与相邻杂质峰分离度均大于1.5，峰形良好，故采用该流动相系统。采用PDA检测器在210～400 nm内对供试品溶液进行扫描，得到3D色谱图，发现在286 nm时各组分的响应值较强，各待测成分色谱峰纯度角均小于纯度阈值，各色谱峰无杂质干扰，因此选择286 nm作为检测波长。
3.3 内参物的选择
原儿茶醛相较于其他丹参酚酸类成分化学性质稳定，对照品价廉易得，且使用HPLC法测定时响应值高[16]，因此本次研究选择原儿茶醛为内参物，保证所建立方法稳定可靠，同时达到降本增效的目的。
本研究建立QAMS法同时测定丹参中7个酚酸类成分，所选用的内参物原儿茶醛化学性质稳定、来源充足，供试品溶液制备方法简便，可用于快速定量制剂中的各指标成分，全面反映丹参配方颗粒的内在质量。各色谱峰分离度好，通过方法学验证、相对校正因子确认、耐用性考察、色谱峰的定位等过程验证，证明建立的方法科学可靠，稳定性良好，可为丹参配方颗粒的整体质量控制和质量评价提供参考。
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