液相色谱-串联质谱法同时测定丹参中139种农药残留

材料

139种农药标准品（Dr.Ehrenstorfer GmbHr公司或Chem Service公司）;乙腈、甲醇、丙酮、乙酸均为色谱纯;无水醋酸钠，无水硫酸镁为分析纯;C18固相萃取柱（400 mg/6 mL）、石墨化碳：乙二胺-N-丙基硅烷混合型固相萃取柱（PC/PSA-SPE）（400 mg：400 mg/6 mL）;吸附剂：N-丙基乙二胺（PSA）、弗罗里硅土（Florisl）、石墨化炭黑（GCB）、十八烷基键合硅胶（C18）、硅胶（Silica）、Chlorofiltr均购于天津博纳艾杰尔科技有限公司;丹参药材均购于上海华宇药业。

1.3 分析样品

实验用丹参样品分别来源于上海华宇药业有限公司、上海养和堂中药饮片有限公司、上海中西制药有限公司共9批，依次编号为1～9。

2 方法与结果

2.1 LC-MS/MS色谱质谱条件

色谱条件：色谱柱：Agilent SB-C18（3.5 μm，2.1×150 mm）;流动相：A相，0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸钠水溶液;B相，乙腈。梯度洗脱程序：0～15.00 min，75% A～10% A;15.00～20.00 min，10% A～10% A;20.00～28.00 min，75% A～25% A。流速：0.40 mL/min;进样量：2.0 μL。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）;扫描方式：正离子扫描;检测方式：多反应监测（MRM）模式;电喷雾电压：5 500 V;雾化气压力：50.0 psi;辅助气压力：50.0 psi;气帘气压力：20.0 psi;碰撞气压力：7.0 psi;离子源温度：500 ℃;扫描时间：50 ms;碰撞室入口电压：10 V;碰撞室出口电压：12 V;监测离子对及其相关质谱参数见表1。按照上述LC-MS/MS条件所得139种农药MRM图谱见图1。

2.2 标准品溶液的配制

标准品储备溶液的制备：精密称取各农药对照品适量，根据各农药溶解性加乙腈或甲苯分别制成每1 mL中含1 000 μg的溶液，即得，贮存在4 ℃冰箱中备用。

内标储备溶液的制备：精密称取氘代莠去津（Atrazine-d5）标准品适量，加乙腈溶解并制成每1 mL含1 000 μg的溶液，即得。

混合标准品溶液的制备：精密量取上述标准品储备液适量，用含0.05%醋酸的乙腈分别制成每1 mL含100 μg和 1 000 μg的2种溶液，即得。

内标溶液的制备：精密量取内标储备溶液适量，加乙腈制成每1 mL含6 μg的溶液，即得。

基质混合标准品工作溶液的制备：取丹参空白基质样品3 g，一式6份，同供试品溶液的制备方法处理至“吸取上清液0.5 mL”，置氮吹仪上于40 ℃水浴浓缩至约0.2 mL，分别加入混合标准品溶液（100 μg/L）25 μL、50 μL，混合标准品溶液（1 000 μg/L）25 μL、50 μL、100 μL、200 μL，加乙腈定容至0.5 mL，涡旋混匀，用微孔滤膜滤过（0.22 μm），取续滤液，即得系列基质混合标准品工作溶液。

2.3 供试品制备方法

提取：取供试品，粉碎成粉末（过三号筛），取约3 g（精确至0.01 g），置50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，涡旋使药粉充分浸润，放置30 min，精密加入乙腈15 mL与内标溶液100 μL，涡旋使混匀，置振荡器上剧烈振荡（500次/min）5 min，加入无水硫酸镁与无水醋酸钠的混合粉末（4∶1）7.5 g，立即摇散，再置振荡器上剧烈震荡（500次/min）3 min，于冰浴中冷却10 min，离心（4 000 r/min）5 min，待净化。

净化：精密移取上清液9 mL置已预先装有净化材料的分散固相萃取净化管（弗罗里硅土300 mg，十八烷基键合硅胶300 mg，N-丙基乙二胺600 mg，石墨化炭黑150 mg，无水硫酸镁900 mg）中，涡旋使充分混匀，再置振荡器上剧烈震荡（500次/min）5 min使净化完全，离心（4 000 r/min）5 min，精密吸取上清液5 mL，置氮吹仪上于40 ℃水浴浓缩至约0.4 mL，加乙腈定容至1 mL，涡旋使混匀，加入N-丙基乙二胺50 mg、无水硫酸镁150 mg，涡旋60 s使凈化完全，离心（4 000 r/min）5 min，取上清液0.5 mL，涡旋混匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性范围和检出限

按照“2.2”项下的方法配置基质标准溶液，进行测定。以各组分的质量浓度为横坐标（X），各组分的峰面积与内标峰面积比为纵坐标（Y），进行回归分析，结果见表2。139种农药在0.005～0.2 mg/kg线性范围内线性关系良好，相关系数（r）均≥0.99。采用在空白丹参基质中添加较低浓度水平的混合标准品溶液的方法，确定各农药在丹参基质中的最低检出限，本实验是以实际看到峰的最低浓度作为检出限，检出限结果见表2，从表2可得约90%农药的检出限可到达0.005 mg/kg，说明方法的灵敏度高。

2.5 回收率和精密度

将混合标准品储备溶液添加到丹参空白基质中，分别制成质量浓度为10、50、100 μg/kg的加标样品溶液，以“1.3”所述方法进行前处理，一式6份，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。3个加标水平下，除了噻菌灵回收率偏低（67.2～67.9），其余农药的平均回收率为70.2%～126.1%，RSD为1.2%～19.5%，数据表明该方法具有良好的适用性，回收率满足农药残留检测要求。

2.6 样品测定结果

采用所建立的分析方法对9批丹参药材进行农药残留检测，样品测定结果见表3。

3 讨论

3.1 检测农药品种的选择 根据我国中药材中农药的施用情况，并参照国内外农药残留监测动向，依据以下原则选择检测农药的品种：国内国际禁限用农药品种的名单;在我国有关部门登记常用农药中毒性较大，对人类存在“三致”危险的农药;我国食品国家标准（GB）中监控的农药，且毒性较大的农药;美国、欧洲等各国药典针对植物药的农药残留监控的品种。根据以上原则筛选的农药品种再结合液相色谱串联质谱分析的特点，最终选择检测农药为139种。

3.2 提取方法的优化

3.2.1 提取方式的选择 选用丹参阳性样品（检出多菌灵），分别采用加水浸泡后提取的改良QuEChERS法与直接用乙腈提取的匀浆法提取，实验发现改良QuEChERS法的药材溶胀率为匀浆法的3倍左右，且改良QuEChERS法的提取效率明显高于匀浆法，这是由于中药材丹参含水量较少，直接使用有机溶剂难以有效提取目标分析物;而加水溶胀后提取溶剂可渗入细胞及组织内部，提高提取效率，故最终采用改良QuEChERS法提取。

3.2.2 提取溶剂的选择 目前，农药多残留检测常用的提取溶剂有乙酸乙酯、丙酮和乙腈。乙酸乙酯由于与水不互溶，不易渗入植物细胞，不利于农药萃出。本研究比较了丙酮、乙腈2种提取溶剂，结果显示（图2），丙酮提取液的颜色远深于乙腈，说明提取液中共萃物的杂质较多，对后续净化与分析过程产生不利影响，且丙酮的沸点较低，易于挥发，提取时易造成提取溶剂的体积变化;而乙腈适合的农药极性范围较广，可以有效萃取丹参中的农药残留同时减少糖类、色素与脂肪类成分等共萃物的提取，故而选用乙腈作为提取溶剂。

3.2.3 浸泡时间的考察 本实验考察了不同浸泡时间对提取效率的影响。选用丹参阳性样品（检出多菌灵）加水分别浸泡0.5、1、3 h，然后加乙腈振荡提取。结果可见，不同浸泡时间对于阳性样品表现出一致的提取效率，说明浸泡0.5 h即可将残留农药提取完全，故最终确定浸泡时间为0.5 h。

3.2.4 盐析剂的选择 QuEChERS法中盐析剂的使用可以促进目标化合物由水相分配至有机相中。本实验比较了NaCl和NaAc 2种盐析剂，实验发现2种盐析剂对农药回收率的影响没有明显的区别，平均回收率分别为102.7%和98.3%。但在提取液中加入NaAc，可以使提取液形成HAc-NaAc缓冲系统，保证萃取液的pH值稳定在4～5之间，从而减少或防止在碱性或中性环境中不稳定农药的降解，提高了方法的适用范围;且采用NaAc作为盐析剂的提取液颜色明显浅于NaCl（图2），说明其中色素等共提取较少，故最终选择NaAc作为盐析剂。

3.3 净化条件的优化

3.3.1 净化方法的选择

目前，农药多残留的常用净化方法有固相萃取法（SPE）和分散固相萃取法（d-SPE）。本实验比较了固相萃取法（C18柱/500 mg、GCB/PSA串联柱/400 mg/400 mg/）、一次分散固相萃取净化法（Florisl/300 mg、C18/300 mg、PSA/300 mg、GCB/150 mg、无水硫酸镁/900 mg）、二次分散固相萃取净化法（①Florisl/300 mg、C18/300 mg、PSA/300 mg、GCB/150 mg、无水硫酸镁/900 mg②PSA50 mg，无水硫酸镁150 mg）。通过比较净化液的颜色深浅来评价净化效果，实验发现二次d-SPE净化法效果最佳，SPE法次之，一次d-SPE净化法稍差;并且二次d-SPE法较SPE法操作简便，重复性好，溶剂用量少，耗时短，故本实验选择二次d-SPE净化法作为净化方法。

3.3.2 净化材料的优选

3.3.2.1 一次净化材料的选择

针对丹参基质主要含有脂溶性色素类、水溶性酚酸类、黄酮类、三萜类和甾醇类等干扰成分。本实验比较了C18、PSA、Florisl、Silica、GCB和Chlorofiltr等六种净化材料。其中GCB与Chlorofiltr均可用于除去基质中的色素类杂质，但GCB的净化效果明显好于Chlorofiltr，且用量较少，故选择GCB作为净化材料;Florisl和Silica均可用于除去羟基类及含杂原子或杂環化合物的极性干扰物，但Florisl的净化效果较好，故选择Florisl作为净化材料;C18可去除丹参基质中的脂类和甾醇类干扰成分;PSA可去除与GCB不同的有机酸和极性色素类干扰成分。故最终优选GCB、C18、PSA及Florisl作为净化材料，4种净化材料具有不同的净化机理，一次净化，可去除多种干扰成分。

3.3.2.2 二次净化材料的选择

针对丹参中色素类干扰成分多的特点，选择了GCB、PSA和Florisl 3种净化材料进行考察，实验发现GCB/15 mg与PSA/50 mg净化效果相当，Florisl/50 mg稍差;由于GCB对个别含平面及对称结构的农药有一定的吸附作用，故最终选择PSA/50 mg作为二次净化的净化材料。

3.3.3 净化材料配比的考察

3.3.3.1 GCB用量的考察

GCB虽然可以有效地去除色素，但由于其表面的正六元环结构会吸附一些平面及对称结构的农药（如多菌灵、蝇毒磷、嘧菌环胺、噻菌灵、三环唑等），导致这些组分回收率降低。所以GCB用量要根据基质所含色素干扰成分的多少决定，使其既能起到净化作用又不降低这类农药的回收率。本实验对不同用量的GCB进行了考察，由图3可见多菌灵、蝇毒磷等5种农药随着GCB用量的增加，回收率逐渐减小;当GCB用量为150 mg时，回收率符合要求，所以确定GCB的用量为150 mg。

3.3.3.2 PSA、C18、Florisl用量的考察

在石墨化炭黑用量确定的基础上，对PSA、C18和Florisl 3种净化材料的用量进行考察。采用紫外光谱扫描，分别比较了3种净化材料的用量为300 mg、600 mg、900 mg时的净化效果，实验发现随着Florisl、C18用量的增加，对丹参提取液的净化效果没有明显的提升;而随着PSA用量的增加，对丹参提取液的净化效果提升明显，故确定增加PSA的用量。

考察了PSA的用量对农药回收率的影响，实验发现增大PSA用量，虽然净化效果明显，但对部分农药的回收率产生影响，不能满足检测要求;而当PSA用量为600 mg时，各农药的回收率最佳，因此最终确定净化材料的配比为Florisl/300 mg，C18/300 mg，PSA/600 mg，GCB/150 mg，无水硫酸镁/900 mg。

3.4 基质效应的评价

基质效应是指基质中共提取干扰物影响目标化合物的离子化，从而使化合物在仪器上的响应发生增强或抑制。因此，需要对目标化合物的基质效应进行评价，并根据评价结果选择适合的方法对基质效应进行抵消。本试验通过测定溶剂标准溶液和基质标准溶液，分别建立标准曲线，比较两条标准曲线斜率的差异，从而判断基质效应的强弱，计算公式如下：基质效应=[（基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率）-1]×100%。实验发现，139种农药中，仅16种农药的基质效应不明显（±30%），其余123种农药均产生中等和较强的基质抑制效应（<-30%）。由于基质抑制效应明显，最终采用基质匹配内标标准曲线法对样品中的农药残留进行定量，以抵消基质效应的影响。

3.5 丹参检测结果分析

9批丹参药材中有7批检出1～2种农药，检出率为78%;检出农药分别为多菌灵、吡虫啉、啶虫脒;且有6批药材均检出多菌灵，提示多菌灵为丹参种植常用农药，需加强丹参中多菌灵的监测。

本研究采用改良的QuEChERS提取，针对丹参基质研发的二次分散固相萃取法净化，建立了液相色谱-串联质谱同时测定丹参中139种农药残留的分析方法。该方法样品前处理简单，灵敏度、准确性均能满足农药残留检测要求，为中药材丹参中多类别农药残留的快速筛查、风险评估等研究提供了一种高效、可靠的分析手段。

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