温度对双眉藻生长的影响
材料，研究不同温度条件（20、30、35及38℃）对藻细胞的油脂、可溶性蛋白和总糖3种主要同化物含量的影响，以及温度对比生长速率的影响，优化温度培养条件，为该株微藻的生产和商业化应用提供实验基础和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
双眉藻分离自海口市白沙门海域。以f/2培养基[12]单藻种静止培养。室温（27±2）℃，光周期为14 h∶8 h，光照4 000 lx，培养期间每天定时摇瓶3次。
取指数生长期藻液，按1∶5比例接种于3 L 玻璃三角瓶中。摇匀后分装于250 mL三角瓶中，每瓶200 mL藻液。海水取自海口市白沙门，盐度30‰，pH8.1。过滤后高压灭菌。实验设4个处理：20、30、35、38℃，每个处理3个重复。
1.2 方法
1.2.1 生长测定
双眉藻培养6 d后离心（5 000 g，Sigma 3-30K）收集，去离子水清洗一次，再次离心获得藻细胞沉淀。藻细胞冷冻干燥（Labconco）后以精密分析天平（MA200，上海良平仪器仪表有限公司）称重。据以下公式计算双眉藻的比生长速率（K）和细胞倍增时间：
K=（lnN2-lnN1）/（t2-t1）（1）
T=0.693 1/K（2）
式中，K为相对生长速率，t1、t2 为对应的培养时间（3 d），N1和N2分别为t1、t2 时期的细胞干重，T为细胞的平均倍增时间。
1.2.2 总脂、总糖和可溶性蛋白分析
细胞中的总脂用氯仿/甲醇（2/1， v/v）抽提，按照Bligh和 Dyer方法[13]测定细胞总脂含量；考马斯亮蓝染色法测定细胞中可溶性蛋白质含量[14]；硫酸蒽酮法测定细胞总糖浓度[15]。
1.2.3 统计分析
DPS数据处理系统对实验数据进行单因素方差分析[16]，采用Duncan多重比较。
2 结果与分析
2.1 温度对双眉藻生长的影响
随培养温度升高，双眉藻细胞倍增时间缩短。38℃时双眉藻生长最快，比生长率是20℃时的2.8倍。双眉藻在30和35℃时的生长速率无显著差异，均显著低于38℃的，而高于20℃的（p<0.05）。见表1。
2.2 温度对双眉藻细胞中总脂、总糖和可溶性蛋白含量的影响
30和35℃的温度条件最有利于双眉藻油脂的积累，总脂含量达到细胞干重的40%以上；38℃高温条件不利于双眉藻细胞油脂的积累，总脂含量只占细胞干重的12.9%，仅为30℃培养的藻细胞的29%，显著低于其他3个温度组（p<0.05）。见表2。
20℃低温培养的藻细胞的可溶性蛋白和总糖含量均显著高于其他处理（p<0.05），可溶性蛋白和总糖含量分别为细胞干重的12.2%和4.5%。30、35和38℃培养条件下，藻细胞的可溶性蛋白和总糖含量无显著差异（p>0.05）。
3 讨论与结论
海洋底栖硅藻双眉藻（Amphora ssp.）是鲍鱼、海参和海胆等名贵水产动物苗种生产的优质饵料[17-20]。此外，该藻富含油脂和岩藻黄素，其底栖生长特性可使细胞采收脱水的成本比一般浮游微藻藻类低，因此具有生物燃油或保健品生产开发的潜力。本实验结果表明，温度对海南海域筛选的双眉藻HN08的细胞繁殖速率以及油脂、蛋白和糖等同化物的含量均有显著影响。
生长速率是衡量微藻应用价值的重要指标之一。研究结果表明，在20～38℃温度范围内，双眉藻HN08的比生长速率随温度的升高而增加，38℃静止培养条件下的比生长速率显著高于其他温度条件下的，为0.36 d-1。钱振明[8]等对8种底栖硅藻的研究结果表明，在15～25℃时，8种底栖硅藻的比生长率最大，超过30℃不利于藻类的生长。郭峰等[21]研究表明，分离自海南海区的两种热带底栖硅藻亚历山大菱形藻（Nitzschia alexandrina）和矮小卵形藻（Cocconeis diminuta）的最适温度为30℃；黄海立等[22]测定了简单双眉藻（Amphora exigua）生长的最适温度为28～31℃。周一春等[20]测得从西沙永兴岛附近海域分离的双眉藻（Amphora sp.）的最适生长温度为25～30℃。通过比较可知，本实验藻株是一株较耐高温的底栖硅藻。
微藻将光合作用固定的碳用于合成糖、蛋白和脂肪等物质，参于细胞的生长代谢。许多研究认为，糖和蛋白含量在最适生长温度下达到最大含量[8，23]；但脂肪含量的变化较复杂。一般认为，微藻在不良环境下才会启动脂肪的大量合成和积累[24]。周洪琪等[25]对新月菱形藻和铲状菱形藻的研究表明，总脂含量与温度呈负相关关系。在温度较低时，细胞内的脂肪倾向于以多不饱和脂肪酸的形式存在，以维持细胞膜的流动性；而饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸则随温度升高而增多[26]。
本试验结果表明，温度对热带硅藻双眉藻HN08细胞主要成分的影响与前人的研究结果不同。20℃条件下，双眉藻HN08的比生长速率显著低于其他处理，细胞倍增时间是38℃条件下的近3倍，这表明20℃并非双眉藻的最适生长温度。但在此低温条件下，细胞中的总糖和可溶性蛋白的含量达到了各处理温度条件下的最大值，而总脂的积累量却在30～35℃的适宜生长的温度条件下达到最高值。这可能是与藻种间的代谢差异有关。硅藻的贮藏物质主要是油脂。适温条件下细胞的光合碳同化速率最高，由此增加了光合产物（如糖等有机化合物）的量，最终使得细胞内的贮藏碳基化合物脂的积累量也增加。低温条件下，细胞生长增殖缓慢可能是同化物质积累的主要原因。38℃高温条件最有利于微藻细胞的分裂和生长，但3种同化物质含量都不高，尤其是总脂含量显著低于其他温度处理，可能是高温条件下细胞生长代谢速率加快，从而减少了贮藏物质的含量。
大量研究表明，微藻通常具有在逆境条件下积累油脂的特性，单细胞油脂含量的增加往往伴随着藻细胞生物质产量的下降，从而影响油脂最终产量[27-28]。本研究表明，热带硅藻双眉藻HN08在30～35℃条件下的细胞油脂含量达到最高值，细胞生长繁殖也未受到抑制，可以获得最高的油脂产量，因而具有生产生物燃油的潜力。
温度是影响微藻生命活动的重要因素之一，通过调控温度，可改变微藻细胞生长增殖和细胞代谢产物的积累。由实验结果可知，在生产上，可以首先给予藻细胞生长的最适温度条件，待培养藻细胞达到最高生物质产量后，根据藻种生物学特性改变温度条件，从而获得最高的目的产物产量。
参考文献
[1] Raposo M F d J， Morais A M M B d. Microalgae for the prevention of cardiovascular disease and stroke[J]. Life Sciences， 2015， 125： 32-41.
[2] Martin K， Muhr A， Braunegg G. Microalgae as versatile cellular factories for valued products[J]. Algal Research， 2014（6）： 52-63.
[3] Georgianna D R， Mayfield S P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels[J]. Nature， 2012， 488（7 411）： 329-335.
[4] Kiran B，Kumar R， Deshmukh D. Perspectives of microalgal biofuels as a renewable source of energy[J]. Energy Conversion and Management， 2014， 88： 1 228-1 244.
[5] 葸玉琴，崇 梅，朱巧巧，等. 不同氮源对混养小球藻生长和部分生化组成的影响[J]. 西北师范大学学报（自然科学版），2015，51（01）：82-86.
[6] 陈书秀，王伟伟，孙 娟，等. 氮磷浓度对筒柱藻生长及理化成分的影响[J]. 水产养殖，2015，36（01）：27-31.
[7] 金 虹，P.K.Andy Hong，Bao D，等. 不同碳氮源对一株产油小球藻油脂积累的影响[J]. 安徽师范大学学报（自然科学版），2014，37（04）：363-365，400.
[8] 钱振明，邢荣莲，吴春雪，等. 温度对8种底栖硅藻生长及其理化成分的影响[J]. 烟台大学学报（自然科学与工程版），2009，22（01）：30-34.
[9] 祁秋霞. 温度对两种海洋微藻生长与多糖含量的影响[J]. 水产养殖，2011，32（01）：20-23.
[10] Liu Z Y， Wang G C， Zhou B C. Effect of iron on growth and lipid accumulation in Chlorella vulgaris[J]. Bioresource Technology， 2008， 99（11）： 4 717-4 722.
[11] Liu Z Y， Wang G C. Effect of Fe3+ on the growth and lipid content of Isochrysis galbana[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology， 2014， 32（01）： 47-53.
[12] Guillard R R， Ryther J H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella- nana Hustedt and Detonula confervacea（Cleve） Gran[J]. Can J Microbiol， 1962，（8）8： 229-239.
[13] Bligh E G， Dyer W J. A rapid method of total lipid extraction and purification[J]. Can. J. Biochem. Physiol， 1959， 37（08）： 911-917.
[14] 陈均辉，李 俊，张太平，等. 生物化学实验（第四版）[M]. 北京：科学出版社，2008：67-69.
[15] 陈均辉，李 俊，张太平，等. 生物化学实验（第四版）[M]. 北京：科学出版社，2008：16-17.
[16] Tang Q Y， Feng M G. DPS Data processing ystem： Experimental design， statistical analysis， and data mining[M]. Beijing： Science Press， 2007.
[17] 黄海立，杜晓东，周银环. 2 种底栖硅藻饲养杂色鲍幼体和稚贝的饵料效果[J]. 南方水产科学，2011，7（1）：32-38.
[18] 黄海立，杜晓东，周银环. 简单双眉藻培养的生态条件[J]. 水产科学，2011，30（4）：229-232.
[19] 陈世杰，陈 木，卢豪魁，等. 鲍苗的饵料-底栖硅藻培养试验初报[J]. 动物学报，1977，23（1）：47-52.
[20] 周一春，胡超群，彭鹏飞，等. 一株底栖硅藻—双眉藻的优化培养[J]. 海洋科学，2012，36（10）：40-47.
[21] 郭 峰，朱凌俊，柯才焕，等. 两种海洋底栖硅藻的培养条件研究[J]. 厦门大学学报（自然科学版），2005，44（06）：97-101.
[22] 黄海立，杜晓东，周银环. 简单双眉藻培养的生态条件[J]. 水产科学，2011，30（4）：229-232.
[23] 钱振明. 海洋底栖硅藻生长条件及其理化成分的研究[D]. 大连理工大学，2008.
[24] 朱顺妮，王忠铭，尚常花，等. 微藻脂肪合成与代谢调控[J]. 化学进展，2011，23（10）：2 169-2 176.
[25] 周洪琪，Renaud S M，Parry D L，等. 温度对新月菱形藻、铲状菱形藻和杷夫藻的生长、总脂肪含量以及脂肪酸组成的影响[J]. 水产学报，1996，20（3）：235-240.
[26] 李文权，李 芊，廖启斌，等. 温度对四种海洋微藻脂肪酸组成的影响[J]. 台湾海峡，2003，22（01）：9-13.
[27] Sharma K K， Schuhmann H， Schenk P M. High lipid induction in microalgae for 549 biodiesel production[J]. Energies， 2012， 5（5）： 1 532-1 553.
[28] Rodolfi L， Zittelli G C， Bassi N， et al. 553 Microalgae for oil： Strain selection， induction of lipid synthesis and outdoor mass 554 cultivation in a low-cost photobioreactor[J]. Biotechnol Bioeng， 2009， 102（01）： 100-112.