姜黄素对草鱼急性肝损伤的保护作用研究
材料与方法
1.1 试验材料
健康草鱼，体重（50±5.0） g，购于武汉市武湖青鱼良种场。
CCl4（分析纯）购于国药集团化学试剂有限公司；不同浓度CCl4-橄榄油溶液（V/V，下同），配成9%、12%、15%、18%及21%的浓度。
羧甲基纤维素钠购于国药集团化学试剂有限公司，肝胆利康散购于武汉市中博水产生物有限公司，姜黄素购于宁波制药有限公司。肝胆利康散和姜黄素分别用0.5%羧甲基纤维素钠配制成不同试验浓度。
谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 试验条件 试验在循环过滤水族缸中进行，装有充分曝气的自来水，试验期间pH 6.5～7.2，水温 24～34 ℃，DO>5 mg/L。
1.2.2 急性肝损伤模型建立 健康草鱼随机分为6组，每组20 尾，禁食24 h后称体重，按 0.1 mL/10 g腹腔注射9%、12%、15%、18%、21%的CCl4-橄榄油溶液，空白对照组注射等体积橄榄油。注射后分别于24、48、72、96 h采样，每组取鱼5尾，尾静脉采血，4 ℃下静置1 h后3 000 r/min离心10 min，取上清得到血清；取部分肝脏组织用10%甲醛固定。血清中的GPT、GOT活性采用试剂盒进行测定；固定的肝组织制作石蜡切片并用HE染色。若动物在试验中死亡，则不进行测定。
1.2.3 姜黄素药效试验 草鱼随机分为8个组，每组20尾，即5个试验组（5、25、75、150、300 mg/kg姜黄素）、阳性对照组（肝胆利康散100 mg/kg）、损伤组及空白对照组，空白对照组和损伤组口灌0.5%羧甲基纤维素钠，试验组口灌相应剂量药物，按0.1 mL/10 g口灌给药1周。禁食24 h后，按0.1 mL/10 g腹腔注射15%的CCl4-橄榄油溶液，空白对照组注射等体积橄榄油，24 h后每组取鱼5尾，尾静脉采血，4 ℃下静置1 h后3 000 r/min离心10 min，取上清得到血清；取部分肝脏组织用10%甲醛固定。血清中的GPT、GOT活性采用试剂盒进行测定；固定的肝组织制作石蜡切片并用HE染色。
1.2.4 数据分析 采用SPSS17.0统计分析软件进行单因素方差分析和LSD多重比较进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 肝损伤模型的评价
随机分为6组的草鱼，每组 20 尾，禁食 24 h 后称体重，按 0.1 mL/10 g分别腹腔注射9%、12%、15%、18%、21%的CCl4-橄榄油溶液，空白对照组注射等体积橄榄油。18%和21%的CCl4溶液造模组草鱼死亡率分别为40%和55%，其他浓度的处理组和对照组均没出现死亡现象。对9%、12%、15%处理组分别于24、48、72、96 h进行采样，每组取鱼5尾，尾静脉采血。血清中GPT、GOT活性测定结果见图1。从图1中可以看出，9%、12%、15%的CCl4-橄榄油溶液处理24 h均能引起血清中GPT和GOT显著升高（P<0.05），其中15%处理组相对其他两组，升高最为显著；GPT、GOT 24 h后开始下降，而在48 h时呈上升趋势。肝组织切片显微结构见图2，15%剂量攻毒24 h后组织会出现坏死及空泡，而空白对照组肝细胞分布均匀，几乎没有发现有坏死和空泡（图2）。因此，选取15% CCl4攻毒24 h进行造模。
2.2 姜黄素药效试验结果
草鱼随机分为8组，每组20尾，分为空白对照组、损伤组、试验组5组（5、25、75、150、300 mg/kg姜黄素）及阳性对照组（肝胆利康散100 mg/kg），空白对照组和损伤组口灌0.5%羧甲基纤维素钠，试验组口灌相应剂量药物，按0.1 mL/10 g口灌给药。7 d后禁食24 h，按0.1 mL/10 g腹腔注射15%的CCl4-橄榄油溶液，空白对照组注射等体积橄榄油，24 h后每组取鱼5尾，尾静脉采血。从图3可以看出，随着姜黄素含量的增加，GOT和GPT活性先逐渐下调，在150 mg/kg时下调最大。25 mg/kg姜黄素开始对肝损伤有一定的保护作用，随着浓度的升高，逐渐增强，150 mg/kg的保护作用达到最大，与损伤组有显著性差异（P<0.05）。由图4可以看出，在15%的CCl4-橄榄油溶液攻毒24 h后损伤组出现大量空泡和坏死，而阳性组肝胆利康散修复能力最好，几乎没有坏死及空泡，150 mg/kg姜黄素试验组只有少量的空泡，说明对肝损伤有一定的保护作用。因此，150 mg/kg姜黄素对草鱼肝损伤的保护作用最佳。
3 小结与讨论
鱼类肝损伤模型是为了研究鱼类肝损伤、脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化等发病原因，阐述其发生和发展的生物学机制，防治策略与技术等而建立的试验研究模型[14]。利用具有生物学活性的肝损伤模型，高通量地筛选护肝药物并探索其作用原理具有重要意义，但是在水产上，鱼类保肝药物筛选模型的研究鲜有报道[15]。其中CCl4是最早、最广泛应用于试验性肝损伤动物模型的选择性肝毒性物质[16]，其成模率高、重复性好、易操作，适合诱导动物肝损伤模型[17，18]，CCl4致水产动物肝损伤方面的研究在建鲤中已经有报道[19]。CCl4作为典型的肝损伤剂，可通过细胞色素P450作用分解为三氯甲烷自由基（CCl3·）[20]，CCl3·一方面选择性地损伤小叶中央区的肝细胞，另一方面与O2迅速结合转化为过氧化三氯甲烷自由基（CCl3O2·）[21]，这些自由基通过攻击肝细胞膜上磷脂分子引起脂质过氧化，损伤肝细胞；大量自由基无法清除，会加重脂质过氧化[22]；肝细胞的结构严重损伤，导致肝细胞坏死，膜蛋白的合成受阻，胞浆内的可溶性酶渗出，导致血清中的GOT、GPT活性升高[23，24]。因此，本研究选择GOT、GPT等相关生化指标作为肝（细胞）损伤的指标，进行体内急性肝损伤模型的研究，为今后水产保肝药的研制打下基础。
药效试验结果表明，25～300 mg/kg姜黄素能显著抑制 CCl4诱导的血清中GOT、GPT的升高，说明该浓度范围姜黄素能够增强肝细胞抵抗磷脂氧化的作用，保护生物膜完整性，且随着浓度升高，作用增强，在150 mg/kg浓度下达到最大。而300 mg/kg浓度下GOT、GPT活性反而高于150 mg/kg浓度组，反映过高浓度可能不利于鱼体健康，下一步将进行姜黄素对鱼体毒性的研究。150 mg/kg姜黄素作用效果显著（P<0.05），作用效果高于国标药物肝胆利康散，说明姜黄素具有开发渔用保肝制剂的潜力。
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