炭疽、布病、结核病三重PCR检测方法的建立与应用
豆 玲
(甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃 兰州730046)
布鲁氏菌主要侵害动物生殖系统，引起流产，而病原体能够以精液、流产胎衣、乳腺分泌液等排出，人是终末宿主。目前，动物布鲁氏菌病的实验室检测主要以RBPT和SAT等2种免疫学方法检测为主。上述两种方法抗原与血清用量较大，易感染人，且SAT检测时间相对较长，现场检测难以实现。人类通过直接或间接接触炭疽芽孢杆菌可引起传染，对畜牧业的发展和公共卫生安全亦具有严重威胁。炭疽主要以细菌和血清检测为主，细菌学检测操作复杂，费时费力，存在一定的生物安全风险。血清学检测目前尚无商品化诊断试剂盒，因而仅限于一些专门的实验室进行。牛结核病目前以皮内变态反应诊断为主。该方法费时，操作难度大，必须进行现场操作，误差大，假阳性较多。甘肃省历来就是布病、炭疽、结核病的频发地区。因此，寻求并建立一种简单，迅速，系统准确的检测方法，是保障畜牧业发展以及人类健康的迫切需要。PCR方法具有很高的检出率，并且克服了常规方法耗时的缺点，被广泛应用于动物疫病诊断中。本研究通过建立可一次性检测三种病原的三重PCR检测方法，并通过实验验证该方法灵敏度高、特异性强、重复性好，为动物及动物产品混合病菌的快速诊断提供了技术支撑。
1.1 材料
1.1.1 菌株 结核病、布鲁氏菌病阳性灭活菌、炭疽芽孢疫苗来源同文后参考文献第二和第九条提供的出处。
1.1.2 主要试剂 所购买试剂同文后参考文献第二和第九条提供的出处。
1.1.3 主要仪器 小型高速离心机(sigma)、梯度PCR仪(德国Biometra T1)、凝胶成像处理系统(UVIvpro)等。
1.2 方法
1.2.1 设计与合成引物 布氏菌序列为BM21、结核菌序列为IS6110、炭疽质粒PXO1，利用Primer6.0软件，设计三对特异性引物，由上海生工生物合成，其碱基序列、序列与扩增产物长度见表1。
表1 多重 PCR 引物
1.2.2 细菌基因组DNA的提取 对布鲁氏菌液、炭疽芽孢疫苗和结核杆菌液进行灭活后各取100 μL，用一管式口腔拭子试剂盒提取模板DNA。
1.2.3 扩增目的基因片段 以提取的三种模板DNA，进行PCR扩增反应，对扩增后的产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，并使用棋盘法对反应条件进行优化，筛选出最适合的扩增程序见表2。
表2 多重 PCR 反应程序
1.2.4 对PCR产物进行鉴定 回收电泳产物，参照文后参考文献第二和第九条〗中提供的方法进行鉴定。对阳性菌株进行测序，并与在GenBank已登录的序列进行比对，根据同源性高低来鉴定PCR产物的正确性。
1.2.5 特异性试验 建立好的三重PCR方法，对常见的巴氏杆菌、沙门氏菌等基因组DNA进行PCR扩增，比对特异性。
1.2.6 敏感性试验 测定标准阳性DNA浓度，对其按10倍倍比稀释后进行PCR方法检测。
1.2.7 多重PCR检测方法的临床应用 对临床上采集的23份病料进行多重PCR方法检测，并与常规检测结果进行比较，计算其符合率。符合率=(阳性数/总数)×100%
2.1 布鲁氏菌、炭疽杆菌、结核杆菌单一PCR扩增
单一PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳可见，退火温度在56℃时，PCR扩增出布鲁氏菌核酸DNA约255 bp，炭疽杆菌核酸DNA约329 bp，结核杆菌核酸DNA约129 bp三条特异性目的片段，大小与预期相符(如图1)，确定了三重PCR的扩增条件为：预变性95℃5min，变性94℃ 30S，退火56℃ 30S，延伸72℃ 60S，共35个循环，72℃终延伸7 min。
M:DNA标准物;1:结核;2:布氏菌;3:炭疽
2.2 PCR产物鉴定
分析结果显示，PCR阳性质粒与参照的炭疽、布氏菌、结核的苷酸序列同源性在98.0%以上，表明产物为预期扩增的目的片段。
2.3 三重PCR的特异性试验
用建立的三重PCR方法检测三种基因组DNA，均能扩增出相应的特异性目的条带，但对巴氏杆菌、沙门氏菌以及链球菌混合作为模板进行PCR扩增，均未检测到任何扩增产物，从而证实了所建多重PCR方法具有很好的特异性。结果如图2所示。
M:DNA标准物;1:炭疽、布鲁氏菌、结核菌;2:沙门氏菌、巴氏杆菌;3:链球菌、结核杆菌;4:巴氏杆菌、布鲁氏菌;5:炭疽杆菌、链球菌;6:布氏菌、结核杆菌、沙门氏菌;7:炭疽杆菌、布鲁氏菌、巴氏杆菌;8:炭疽杆菌、链球菌、结核杆菌;9:沙门氏菌、巴氏杆菌、链球菌;10:链球菌、沙门氏菌
2.4 三重PCR的敏感性试验
对三种病菌的浓度进行测定，再分别进行10倍梯度的倍比稀释，经多重PCR方法扩增凝胶电泳结果如图3所示，该多重PCR方法对三种病菌的敏感性分别可达313fg/μL、345fg/μL以及322fg/μL以下。
M:DNA标准物质; 1:未稀释;2:10倍稀释;3:102倍稀释;4:103倍稀释;5: 104倍稀释;6: 105倍稀释7:106倍稀释
2.5 三重PCR的重复性试验
对倍比稀释的三种DNA梯度重复检测5次，并对相同样品分别进行5次三PCR与单一PCR扩增检测，所有检测结果一致。
2.6 三重PCR检测方法的可靠性
对三重PCR扩增产物同源性进行分析比较，可达99%～100%，充分证明了该三重PCR方法的可靠性。
2.7 三重PCR方法的临床应用
用建立的多重PCR检测临床上的23份病料，其结果如图4。第7、16、20号三重PCR检测结果样品为阳性，这与布病试管凝集试验检测结果符合率为100%；
第20、22、23、24号样品多重PCR检测结果试验呈阳性，与PPD结果符合率为100%；
同时第20号临床病料布鲁氏菌核酸和结核杆菌核酸双重阳性。
M:DNA 标准物质; 1:炭疽杆菌、布鲁氏菌、结核杆菌;2～24:临床病料
布病、炭疽、结核这三种人兽共患病不但给甘肃省养殖畜牧业的发展带来威胁与巨大的损失，且对人类的健康威胁严重。病原的分离鉴定培养或者传统的实验室检测耗时长，操作繁琐，单一PCR方法具有特异性强的特点，但是对多种病毒混合感染的鉴定不能实现。
本研究通过优化PCR扩增程序，建立三重PCR方法，通过试验均显示检测结果准确可靠。可一次性快速检测鉴别布氏菌病、炭疽和结核三种病原体，这对于鉴别诊断临床多种病原体混合感染的病料上具有独特优势和实用价值。在采样时仅用采集鼻腔棉拭子，相比于传统的采集发病动物血清和组织样本的生物安全风险较低，并能够较好的避免兽医工作人员感染上述人兽共患病。
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