基于微生物转化法制备雄甾-4-烯-3,17-二酮羟化物的研究
于欢 江胜 李悦
（河北达瑞生物科技股份有限公司（河北省甾类医药中间体技术创新中心） 河北保定 071000）
甾体化合物即类固醇化合物，是微生物及动植物体内普遍存在的物质，母核呈环戊烷合并多氢菲结构。依据母核侧链的差异，可以将甾体化合物分为甾醇类药物、甾体生物碱、甾体激素类药物和强心苷类药物等，其中，甾体激素类药物对人体具有强大的调节作用，主要用于治疗风湿病、心血管病、胶原性病、皮肤病、内分泌失调疾病等，成为排名位于抗生素之后临床广泛使用的第二大类药物［1］。
微生物转化法制备甾体化合物是指以微生物代谢产生的酶系作为催化剂，通过与添加的底物相互作用，使其结构发生改变或进行修饰，进而生成具有潜在药理活性的目标化合物过程，包括“筛选菌种→培养孢子或菌丝体→添加甾体化合物→产物提取分离纯化”。传统化学合成方法制备甾体化合物，具有成本高、污染大、生产工艺复杂、产率低、副产物多等诸多缺陷。而采取微生物转化法制备甾体化合物，具有生产工艺简单、催化反应条件温和、步骤少、周期短、成本低、污染少、收率高、副产物少、区域性、选择性、专一性强等优点，正好可以弥补化学合成方法的不足。
微生物转化法制备甾体化合物主要涉及羟基化、环氧化、支链降解、脱氢反应等几种催化反应类型，其中，羟基化是应用最为广泛的一种催化反应类型，因为在甾体化合物母核的任一碳位上都可以引入羟基，生成不同的甾体羟化物［2］。目前，微生物转化法制备甾体化合物研究，主要体现在新药开发、有机合成、哺乳动物药物代谢体外模型实验等几个方面。
1952年，美国的Murray和Peterson以孕酮为底物，用黑根霉转化制备11α-羟基孕酮，转化率高达90%，拉开了甾体激素类药物工业化生产的序幕。1958年，中国黄鸣龙院士以16α，17α-环氧孕酮为底物，用黑根霉转化制备11α-羟化物，为我国运用微生物转化法制备甾体化合物夯实了基础［3］。11α-羟化物是合成抗炎类甾体药的重要中间体，通过C11α-羟化反应，用以改变或修饰底物母核结构，从而增加药效，减少副作用，提高药物商业价值和临床应用价值。目前，用于甾体11α-羟化反应的微生物以霉菌为主，包括黑根霉、黄曲霉、赭曲霉、少根根霉、球孢白僵菌、诺卡氏菌、绿僵菌、放线菌、青霉等，其中，赭曲霉和绿僵菌都存在不同的缺陷，如特异性不明显、活性不稳定、目的产物分离纯化困难等，因此，工业生产中应用最广的还是用黑根霉转化制备11α-羟化物。但是，纵观我国采用微生物转化法制备甾体化合物的医药制造企业，目标产物普遍收率较低，究其原因主要是受到微生物形态结构、甾体化合物水溶性、微生物细胞膜或壁的通透性、底物添加量和产物堆积等因素的影响。因此，迫切需要通过改进转化技术以提高目标产物的收率［4］。
4-AD 又名雄烯二酮，分子式为C19H26O2，可以以4-AD为底物，采用微生物转化法制备雄激素、孕激素、糖皮质激素、蛋白同化激素等甾体激素类药物。目前，市场上以4-AD 为主要原料制备的甾体激素类药物已经达到100 多种，给临床药物治疗提供了更多新的思路。4-AD 作为一种制备甾体激素类药物的重要中间体，在母核结构不同点位上都可以引入羟基，如C-5、C-6、C-7、C-9、C-11、C-14、C-15、C-16、C-17等，合成不同品种的甾体激素类药物。11α-OH-4-AD 是合成高血压、心脏病、利尿剂等甾体激素类药物的重要原料或中间体，由其合成的依普利酮属于醛固酮受体拮抗剂，通过调节肾素—血管紧张素—醛固酮系统来治疗心血管疾病，尤其对于充血性心衰治疗效果更好，而且副作用小［5］。虽然目前利用4-AD转化合成11α-OH-4-AD 的研究不少，但同时满足添加底物量大、目标产物收率高的转化体系还很少，还需要从筛选菌种和优化转化工艺入手，以其提高11α-OH-4-AD的收率。
1.1 实验材料
（1）实验试剂。分析纯包括4-AD、柱层析硅胶、羧甲基纤维素钠、薄层层析硅胶、葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、尿素、硝酸铵、硫酸铵、磷酸氢二钠、吐温-80、硫酸钙、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、氯化钠、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲基-β-环糊精、丙酮、石油醚、无水乙醇、无水甲醇；
生物试剂包括蛋白胨、琼脂、酵母膏、牛肉膏、L-天冬氨酸、麦芽糖、D-木糖；
工业级包括麦芽糊精、玉米粉、豆粕水解液；
色谱纯包括无水甲醇。
（2）实验仪器。GNP-9050 隔水式恒温培养箱、DLHR-Q250 恒温振荡器、BSC-1100IIA2-X 生物安全柜、BCD-219L3C 冰箱、MJ-78A 高压蒸汽灭菌锅、X-5精密显微熔点测定仪、DPX-400超导核磁共振仪、2F-20D暗箱式紫外分析仪、PHS-3C酸度计、OSB-2100旋转蒸发仪、SHB-3循环水多用真空泵、DHG-9000电热恒温鼓风干燥箱、SYU-7-200DTD 超声波清洗机、AUY220 分析天平、OLYMPUS CH-BI45-2 显微镜、LOC-1m 冷冻干燥机、Nicolet i S10 红外光谱仪、Arktik PCR 仪、DYY-8C 电泳仪、Q-Tof Mico TM 高分辨电喷雾质谱仪、250×4.60mm色谱柱、Waters e2695高效液相色谱仪。
1.2 实验方法
（1）菌种筛选与鉴定。菌种筛选的过程也是菌种培养的过程，因此，需要明确各阶段菌种培养对应的培养基组成。转化培养基组成同富集培养基（mg/mL）：葡萄糖30、酵母膏1、蛋白胨12、磷酸二氢钾0.9、pH 值4.5，121℃高压蒸汽灭菌20min后备用。固体培养基组成同分离培养基（mg/mL）：葡萄糖30、酵母膏1、蛋白胨12、琼脂30、磷酸二氢钾0.9、pH 值4.5，121℃高压蒸汽灭菌20min 后备用。初筛培养基（mg/mL）：琼脂30、硫酸镁6.7、硫酸铵0.5、硫酸亚铁0.05、磷酸氢二钠3、磷酸二氢钾1.5、氯化钠0.25、4-AD 1，121℃高压蒸汽灭菌20min后备用。
为了得到转化能力强的菌种，公司将自藏的不同地区采集的土样各取1.0g，在恒温振荡器中进行微生物菌液富集培养2d，在隔水式恒温培养箱中进行初筛培养4～7d，在分离培养基中进行分离纯化，初筛以后获得12 株菌种，依次命名从MH-14 到MH-25。将初筛菌株先在隔水式恒温培养箱中培养4d，再置于恒温振荡器中培养2d，最后向装有转化培养基的锥形瓶加入0.1g用甲基-β-环糊精溶解的4-AD转化4d，用乙酸乙酯浓缩萃取，并进行TLC 检测，结果MH-14、MH-18、MH-19等3株菌种对底物4-AD转化的总收率均超过40%，说明都具有较好的转化能力，其中，MH-18 菌株转化11α-OH-4-AD 的基础收率达到48.50%，是所有转化产物中收率最高的，因此，将MH-18 菌株作为4-AD 转化为11α-OH-4-AD 的研究对象。将MH-18菌种置于固体培养基中培养4d，观察菌落颜色变化和光学显微镜下的形态结构，菌落正面颜色逐渐由白色变为深黑褐色，分生孢子呈球形或近球形，初步判定属于曲霉属。然后采用超声法进行DNA测序，通过提取MH-18 的总DNA、检测DNA 的浓度和质量、扩增ITS序列的PCR、扩增产物琼脂糖凝胶电泳、测序、序列分析等，结果表明，MH-18 菌株与泡盛曲霉（Aspergillus awamori）同源，符合率高达100%。
（2）MH-18 转化4-AD。首先，从固体培养基取出1 支MH-18 菌种放于生物安全柜中，然后将适量菌体分别接种到装有转化培养基的8 瓶锥形瓶中，置于恒温振荡器中培养2d。其次，将用甲基-β-环糊精溶解的4-AD 分装到8 瓶锥形瓶中，每瓶装含有0.2g 甲基-β-环糊精包埋分散好的0.2g4-AD，置于恒温振荡器中培养4d。再次，将发酵液经减压抽滤、有机相与滤液合并、减压浓缩、饱和碳酸氢钠溶液脱色、饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸镁干燥、减压蒸馏等步骤得到转化产物。最后，将转化产物经柱层析分离，乙酸乙酯与石油醚的比例是1∶3，主要得到7α-OH-4-AD、11α-OH-4-AD、14α-OH-4-AD 这3 种产物，其中，11α-OH-4-AD的转化率为84.02%，比初始转化率提高35.52%。
微生物转化法合成甾体化合物包括菌株培养和甾体底物转化两个过程，相应工艺优化也主要包括培养条件优化和转化条件优化两个方面。以4-AD 为底物，利用泡盛曲霉菌株MH-18 转化目标产物11α-OH-4-AD，其基础转化率可达48.50%，转化率相对较高，对其培养条件和转化条件分别进行优化，以进一步提高目标产物11α-OH-4-AD 产率，为我国医药制造企业采用微生物转化法制备甾体化合物提供更多理论指导。
2.1 MH-18菌株生长曲线测定
以时间和菌体干重分别为横坐标和纵坐标，按12h 取样1 次，绘制MH-18 菌株生长曲线，结果发现，菌体生长可以分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期4个阶段，对应的时间段分别为12～24h、24～48h、48～72h和72h 后，因此底物4-AD 添加时间为MH-18 菌株生长48h。
2.2 培养条件优化
（1）保持初始转化培养基其他组成成分固定不变，分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、乳糖、糊精、淀粉作为碳源，结果目标产物11α-OH-4-AD 转化率糊精最高，因此选择糊精作为碳源。然后分别以12.5mg/mL、22.5mg/mL、32.5mg/mL、42.5mg/mL、52.5mg/mL、62.5mg/mL、72.5mg/mL 作为糊精添加浓度，结果目标产物11α-OH-4-AD 转化率在糊精浓度为32.5mg/mL 时最高，因此选择糊精浓度为32.5mg/mL。
（2）保持初始转化培养基其他组成成分固定不变，分别以蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米粉、豆粕水解液、硝酸铵、尿素、L-天冬氨酸作为氮源，结果目标产物11α-OH-4-AD 转化率玉米粉和牛肉膏相对较高，而玉米粉成本较低，因此选择玉米粉作为氮源。然后分别以5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL 作为玉米粉添加浓度，结果目标产物11α-OH-4-AD 转化率在玉米粉浓度为10mg/mL 时最高，因此选择玉米粉浓度为10mg/mL。
（3）保持初始转化培养基其他组成成分固定不变，分别以硫酸钙、硫酸镁、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾作为无机盐，结果目标产物11α-OH-4-AD 转化率磷酸二氢钾最高，因此选择磷酸二氢钾作为无机盐［6］。然后分别以0.3mg/mL、0.6mg/mL、0.9mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2.1mg/mL 作为磷酸二氢钾添加浓度，结果目标产物11α-OH-4-AD 转化率在磷酸二氢钾浓度为1.2mg/mL时最高，因此选择磷酸二氢钾浓度为1.2mg/mL。
（4）保持初始转化培养基其他组成成分固定不变，分别以3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5作为初始pH值，结果目标产物11α-OH-4-AD 转化率在pH 值为4.5 时最高，因此选择的pH值为4.5。
（5）对培养基组成的响应面进行实验优化，以糊精、玉米粉、磷酸二氢钾、pH 值4.5 作为影响因素，以11α-OH-4-AD 转化率作为响应值，然后利用Design-Expert 8.0.6 软件进行响应面分析实验和参数优化，结果确定的最优培养条件为糊精33.6mg/mL、玉米粉10.5mg/mL、磷酸二氢钾1.2mg/mL、pH值为4.5。
2.3 转化条件优化
（1）固定优化后的培养基组成成分，分别以28℃、30℃、32℃、34℃、36℃作为转化温度，结果目标产物11α-OH-4-AD 转化率在32℃时最高，因此选择的转化温度为32℃。
（2）固定优化后的培养基组成成分，分别以140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min、240r/min作为摇床转速，结果目标产物11α-OH-4-AD 转化率在200r/min时最高，因此选择的摇床转速为200r/min。
（3）固定优化后的培养基组成成分，分别以60mL、80mL、100mL、120mL、140mL 作为装液量，结果目标产物11α-OH-4-AD 转化率在100mL 时最高，因此选择的装液量为100mL。
（4）固定优化后的培养基组成成分，分别以吐温-80、甲醇、甲基-β-环糊精、乙醇、丙酮、二甲基亚砜作为底物4-AD助溶剂，结果甲基-β-环糊精作为助溶剂时，目标产物11α-OH-4-AD转化率最高，因此选择甲基-β-环糊精作为助溶剂。
（5）固定优化后的培养基组成成分，分别以0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L 作为底物4-AD 浓度，结果4-AD浓度为1g/L时，目标产物11α-OH-4-AD转化率最高，因此选择的4-AD浓度为1g/L。
（6）固定优化后的培养基组成成分，分别以24h、48h、72h、96h、120h、144h 作为转化时间，结果目标产物11α-OH-4-AD 转化率在96h 时最高，因此选择96h作为转化时间。
最终确定的最优转化条件为转化温度32℃、摇床转速200r/min、装液量100mL、助溶剂甲基-β-环糊精、4-AD添加浓度1g/L、转化时间96h。
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