circ_0026344,靶向miR-938,调控肺癌A549,细胞迁移、侵袭及凋亡的分子,机制研究

肖 磊 杨志雄 赖微微 刘升明 （广州医科大学附属第二医院番禺院区呼吸内科，广州 510140）

肺癌是全球癌症患者死亡的主要原因，针对肿瘤中特定分子改变的靶向治疗已在肺癌治疗中取得一定进展，但多用于腺癌，且存在一定局限性，因此深入研究其分子作用机制，从而研发新的靶向药物，精确指导癌症治疗至关重要［1-2］。环状RNA （circRNA）是一类新的非编码RNA，在人类疾病中起重要作用；
差异表达的circRNA 可作为肺癌诊断的潜在生物标志物。进一步研究circRNA 在肺癌发病机制和调控途径中的作用有利于开发诊断和准确治疗肺癌的新方法［3］。研究报道，结直肠癌组织中circ_0026344表达下调，circ_0026344异位表达通过海绵化miR-21 和miR-31 抑制结直肠癌细胞生长和侵袭，并促进其凋亡［4］。胃癌组织中circ_0026344表达降低，其表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM 分期和浸润深度显著相关；
circ_0026344 表达下调与肿瘤恶性行为有关，且是胃癌预后的潜在生物标志物［5］。但circ_0026344 在肺癌中的表达及其对肺癌A549细胞迁移、侵袭及凋亡的影响及分子机制尚不清楚。研究表明，miRNA 可能在包括肺癌在内的各种癌症进展中起关键作用，如肺腺癌组织中miR-938 水平上调，其表达与肿瘤大小显著相关，miR-938 通过调节RNA 结合基序蛋白5（RNA-binding motif protein 5，RBM5）促进 肺 腺 癌 细 胞 增 殖［6］。miR-938 通过抑制PH 结构域和富含亮氨酸重复序列的蛋白质磷酸酶2（PH domain and leucine rich repeat protein phosphatases isoform 2，PHLPP2）促进结直肠癌细胞增殖［7］。因此，本研究旨在探讨circ_0026344 在肺癌中的表达及其对肺癌细胞A549 迁移、侵袭及凋亡的影响及分子机制是否与miR-938有关。

1.1 材料

1.1.1 组织来源 选取2017年1月至2019年12 月 广州医科大学附属第二医院病理科存档且已确诊为肺癌的患者肿瘤组织及相应癌旁组织39 例， 年龄25～78岁，平均（41.6±1.6）岁。

1.1.2 细胞与主要试剂 肺癌细胞A549购自上海雅吉生物科技有限公司；
RPMI1640 培养基购自美国Gibco 公司；
Trizol 试剂、反转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒购自上海联硕生物科技有限公司；
Transwell小室、Matrigel购自美国BD 公司；

BCA 试剂盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞处理与分组 肺癌A549 细胞采用 RPMI1640 培养液常规培养，取对数生长期细胞，分别转染pcDNA、pcDNA-circ_0026344、si-NC、si-circ_0026344、anti-miR-NC、anti-miR-938，记为pcDNA组、pcDNA-circ_0026344组、si-NC组、si-circ_0026344组、anti-miR-NC 组、anti-miR-938 组；
将pcDNA-circ_00-26344 分别与miR-NC、miR-938 共转染至A549 细胞，记为pcDNA-circ_0026344+miR-NC 组、pcDNAcirc_0026344+miR-938组。

1.2.2 RT-qPCR 检 测circ_0026344 和miR-938 表达 提取组织和细胞总RNA，反转录为cDNA，按照试剂盒说明进行PCR反应，反应体系：2 µl反转录产物、10 µl SYBR Green Mix、正反向引物各0.5 µl、 7 µl 无菌水；
循环条件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；
72 ℃ 30 s，共40 个循环；
circ_0026344 和miR-938 分别以GAPDH和U6为内参，2-ΔΔCt法计算。

1.2.3 Transwell 检测细胞迁移和侵袭 细胞迁移实验：Transwell 小室上室和下室分别加入200 µl 细胞悬液和600 µl RPMI1640 完全培养液，培养24 h，多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜观察并拍照，计算迁移细胞数。细胞侵袭实验：采用基质胶Matrigel包被Transwell上室，其余操作同细胞迁移实验。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，漂洗，按试剂盒说明操作，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 Western blot 检测蛋白表达 提取细胞总蛋白，定量后进行电泳，转至聚偏二氟乙烯膜，封闭液封闭后加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育2 h，ECL 发光液显影，分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参计算目的蛋白相对表达。

1.2.6 双荧光素酶报告实验检测circ_0026344 和miR-938 的靶向关系 构建circ_0026344 的野生型和突变型荧光素酶表达载体WT-circ_0026344 和MUT-circ_0026344，采用LipofectamineTM2000 将其分别与miR-NC 和miR-938 共转染至A549 细胞，按照说明书检测荧光素酶活性。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用±s表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 肺癌组织circ_0026344 表达 与癌旁组织（1.00±0.05）比 较，肺 癌 组 织circ_0026344 表 达（0.33±0.04）降低（P＜0.05）。

2.2 circ_0026344 过表达对肺癌细胞A549 迁移、侵袭的影响 与pcDNA 组比较，pcDNA-circ_00-26344 组肺癌A549 细胞circ_0026344 表达升高，迁移、侵袭细胞数减少，MMP-2、MMP-9 表达降低（P＜0.05，表1、图1）。

图1 迁移、侵袭相关蛋白表达Fig.1 Migration and invasion related proteins expressions

表1 circ_0026344过表达对肺癌A549细胞迁移、侵袭的影响（±s，n=9）Tab.1 Effect of circ_0026344 over-expression on migration and invasion of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

表1 circ_0026344过表达对肺癌A549细胞迁移、侵袭的影响（±s，n=9）Tab.1 Effect of circ_0026344 over-expression on migration and invasion of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA group， 1）P＜0.05.

2.3 circ_0026344 过表达对肺癌A549 细胞凋亡的影响 与pcDNA 组比较，pcDNA-circ_0026344 组肺癌A549 细胞凋亡率升高，Bcl-2 表达降低，Bax 表达升高（P＜0.05，表2、图2）。

图2 circ_0026344过表达对肺癌A549细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of circ_0026344 over-expression on apoptosis of lung cancer A549 cells

表2 circ_0026344 过表达对肺癌A549 细胞凋亡的影响 （±s，n=9）Tab.2 Effect of circ_0026344 over-expression on apoptosis of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

表2 circ_0026344 过表达对肺癌A549 细胞凋亡的影响 （±s，n=9）Tab.2 Effect of circ_0026344 over-expression on apoptosis of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA group， 1）P＜0.05.

2.4 circ_0026344 靶向调控miR-938 表达 Circular RNA Interactome 预测显示，circ_0026344 序列中含有与miR-938 互补的核苷酸序列（图3）。与miRNC 组 比较，miR-938 组转染WT-circ_0026344 的细胞荧光素酶活性降低（P＜0.05，表3）。过表达circ_0026344，miR-938 表达降低，抑制circ_0026344 表达，miR-938表达升高（P＜0.05，表4）。

表3 双荧光素酶报告实验（±s，n=9）Tab.3 Double luciferase report experiment （±s，n=9）

表3 双荧光素酶报告实验（±s，n=9）Tab.3 Double luciferase report experiment （±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group， 1）P＜0.05.

表4 circ_0026344调控miR-938表达（±s，n=9）Tab.4 circ_0026344 regulates expression of miR-938 （±s，n=9）

表4 circ_0026344调控miR-938表达（±s，n=9）Tab.4 circ_0026344 regulates expression of miR-938 （±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA group， 1）P＜0.05；

compared with si-NC group， 2）P＜0.05.

图3 circ_0026344 序列中含有与miR-938 互补的核苷酸序列Fig.3 Sequence of circ_0026344 contains a nucleotide sequence complementary to miR-938

2.5 抑制miR-938 表达对肺癌A549 细胞迁移、侵袭及凋亡的影响 与癌旁组织（1.00±0.08）比较，肺 癌 组 织miR-938 表 达（4.34±0.26）升 高（P＜0.05）；
与anti-miR-NC 组比较，anti-miR-938 组肺癌A549 细胞miR-938 表达降低，迁移、侵袭细胞数减少，细胞凋亡率升高，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表达降低，Bax表达升高（P＜0.05，图4、表5）。

表5 抑制miR-938表达对肺癌A549细胞迁移、侵袭及凋亡的影响（±s，n=9）Tab.5 Effect of inhibiting expression of miR-938 on migration， invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

表5 抑制miR-938表达对肺癌A549细胞迁移、侵袭及凋亡的影响（±s，n=9）Tab.5 Effect of inhibiting expression of miR-938 on migration， invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

Note：Compared with anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

Bax protein 0.21±0.02 0.58±0.041）24.820 0.000 Groups anti-miR-NC anti-miR-938 t P miR-938 1.00±0.06 0.24±0.021）36.050 0.000 Migration cell number 89.51±6.08 44.18±3.181）19.820 0.000 Invasive cell number 67.35±5.09 33.29±3.111）17.130 0.000 Apoptosis rate/%7.47±0.54 19.90±1.831）19.544 0.000 MMP-2 protein 0.69±0.05 0.30±0.021）21.726 0.000 MMP-9 protein 0.58±0.03 0.23±0.021）29.122 0.000 Bcl-2 protein 0.83±0.06 0.45±0.031）16.994 0.000

图4 抑制miR-938表达对肺癌A549细胞迁移、侵袭及凋亡的影响Fig.4 Effect of inhibiting expression of miR-938 on migration， invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells

2.6 miR-938过表达逆转了circ_0026344过表达对肺癌A549细胞迁移、侵袭及凋亡的作用 与pcDNAcirc_0026344+miR-NC组比较，pcDNA-circ_0026344+miR-938 组迁移、侵袭细胞数增多，细胞凋亡率降低，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表达升高，Bax 表达降低 （P＜0.05，图5、表6）。

表6 miR-938过表达逆转了circ_0026344过表达对肺癌A549细胞迁移、侵袭及凋亡的作用（±s，n=9）Tab.6 Over-expression of miR-938 reverses effect of over-expression of circ_0026344 on migration， invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

表6 miR-938过表达逆转了circ_0026344过表达对肺癌A549细胞迁移、侵袭及凋亡的作用（±s，n=9）Tab.6 Over-expression of miR-938 reverses effect of over-expression of circ_0026344 on migration， invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells （±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA-circ_0026344+miR-NC group， 1）P＜0.05.

Bax protein 0.62±0.04 0.32±0.031）18.000 0.000 Groups pcDNA-circ_0026344+miR-NC pcDNA-circ_0026344+miR-938 t P miR-938 1.00±0.05 3.08±0.221）27.658 0.000 Migration cell number 38.69±3.68 75.68±3.961）20.527 0.000 Invasive cell number 27.45±2.53 57.12±3.491）20.649 0.000 Apoptosis rate/%25.01±2.42 12.96±1.071）13.662 0.000 MMP-2 protein 0.23±0.02 0.58±0.031）29.122 0.000 MMP-9 protein 0.15±0.02 0.45±0.041）20.125 0.000 Bcl-2 protein 0.37±0.03 0.70±0.051）16.978 0.000

图5 miR-938 过表达逆转了circ_0026344 过表达对肺癌A549细胞迁移、侵袭及凋亡的作用Fig.5 miR-938 over-expression reverses effect of circ_0026344 over-expression on migration，invasion and apoptosis of lung cancer A549 cells

肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤，随着分子机制研究深入、分子诊断技术不断发展，靶向药物改善了肺癌传统治疗情况，为患者生存带来了新希望［8-9］。越来越多的研究表明，circRNA 与肺癌细胞增殖、迁移和侵袭有关，可作为肺癌诊断和预后的新型生物标志物［10］。如沉默circ-BANP 在体外显著抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭［11］。而circ_0026344 对肺癌的影响尚未有研究报道。本研究显示，与癌旁组织比较，肺癌组织circ_0026344 表达降低；
circ_0026344 过表达后，A549 细胞迁移、侵袭数减少，凋亡率升高，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表达降低，Bax 表达升高，表明circ_0026344 过表达可抑制肺癌细胞迁移、侵袭，并促进细胞凋亡。研究报道，circ_0026344 过表达可抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭［12］。提示circ_0026344 在癌症中可能起抑癌基因作用。

研究报道，替莫唑胺抗性亚型的胶质母细胞瘤中miR-938 呈过表达［13］。本研究显示，肺癌组织miR-938 表达升高，抑制miR-938 表达，A549 细胞迁移、侵袭数减少，凋亡率升高，说明抑制miR-938 表达可抑制肺癌A549 细胞迁移、侵袭，且促进细胞凋亡。此外，circRNA 可充当miRNA 的竞争性内源性RNA 影响细胞增殖、迁移和侵袭等［14］。如circ_100395 过表达通过调控miR-1228 显著抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭［15］。抑制circRNA_100146 通过调控miR-361-3p 和miR-615-5p 表达抑制非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭，并促进细胞凋亡［16］。本研究通过Circular RNA Interactome 预测circ_0026344 可能结合的miRNA，结果显示circ_0026344 与miR-938存在结合位点。双荧光素酶报告实验验证circ_0026344可靶向调控miR-938表达，进一步同时过表达miR-938 和circ_0026344 后迁移、侵袭细胞数增多，细胞凋亡率降低，说明miR-938 过表达逆转了circ_0026344 过表达对肺癌A549 细胞迁移、侵袭及凋亡的作用。提示circ_0026344可能通过调控miR-938表达影响肺癌细胞迁移、侵袭及凋亡。

综上所述，circ_0026344 过表达可能通过靶向下调miR-938 表达抑制肺癌A549 细胞迁移、侵袭，并促进细胞凋亡。

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