葡萄生单轴霉菌对葡萄几种防御酶活性的影响

材料，通过室内人工接种方法研究葡萄生单轴霉菌侵染后不同葡萄品种过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及过氧化氢酶（CAT）活性的变化。结果表明，受葡萄生单轴霉菌侵染后不同抗性品种POD、PPO、PAL和CAT活性与对照相比均明显提高，抗病品种酶活性较感病和高感品种上升快且维持较高活性水平，抗性品种酶活性均出现2个高峰，第1个酶活性高峰较感病品种出现得早;抗病品种CAT和PAL活性较感病品种上升幅度更大，维持时间更长。

关键词：葡萄生单轴霉菌;过氧化物酶;多酚氧化酶;苯丙氨酸解氨酶;过氧化氢酶;葡萄霜霉病抗性机制

中图分类号：S436.631

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）15-0151-03

植物的抗病反应是寄主-病原物相互作用过程中所产生的一系列生理生化效应，保护反应是复杂的新陈代谢的结果，植物对病原物侵入的生理反应是通过酶的催化活动实现的。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）及过氧化氢酶（CAT）是植物体内重要的保护酶和防御酶。大量研究表明，这些酶在寄主与病原物互作中与植物的抗病性有着重要的关系[1-3]。

葡萄霜霉病是由葡萄生单轴霉（Plasmopara viticola）引起的葡萄生产上最重要的病害之一，世界各地葡萄产区均有发生，是一种世界性病害[4-5]。据调查，2010年我国葡萄栽培面积达55.2万hm2，严重发病地块的葡萄霜霉病发生率高达70%以上。1834年在美国东北部的野葡萄上首次发现了葡萄霜霉病[6-7]。我国1899年发现该病危害[8]，目前几乎所有的葡萄产区都有发生，潮湿多雨地区危害更为严重，发病时严重影响树势和果实品质[9]。关于葡萄霜霉病的抗性研究主要集中在品种抗病性鉴定、病菌致病性分化及抗药性等方面[10-14]，而与抗性有关的防御酶活性研究较少。因此，本研究以生产中主栽的鲜食葡萄品种为材料，研究不同抗性葡萄品种感染葡萄生单轴霉菌后POD、PPO、PAL及CAT活性的变化，以期丰富葡萄霜霉病抗性机制研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试葡萄品种为高妻、夏黑、红地球、瑞比尔。

供試葡萄品种于2013年秋季扦插于甘肃省农业科学院植物保护研究所温室中。2014年8月从田间采集新鲜的葡萄霜霉病叶片，用自来水反复冲洗掉老孢子囊后，在20 ℃条件下黑暗保湿培养24～48 h，待新孢子囊长出后用毛笔刷下新鲜孢子囊，用无菌水配制成浓度为1×105～1×106个/mL孢子囊悬浮液备用。

1.2 试验方法

1.2.1 品种抗性评价 采用室内离体叶片法结合田间自然发病调查进行品种抗性评价。室内离体叶片测定时分别采集供测试葡萄品种新梢大小和叶龄基本一致的健康叶片，将事先准备好的孢子囊悬浮液用喉头喷雾器在叶片背面均匀喷洒10 mL，然后将叶片正面朝下放在铺有4层无菌水浸湿灭菌纱布的瓷盘中，为避免叶片与湿纱布接触腐烂，在叶片下放置玻璃棒，叶柄用脱脂棉保湿，磁盘用保鲜膜覆盖密封，于 20 ℃ 条件下黑暗保湿培养。以喷等量清水为对照，每个品种接种10张叶片，重复3次。逐日观察记录发病情况，最后用接种后7 d的调查数据计算病情指数。

田间自然发病调查参考刘天明等的方法[15]，2014年在甘肃省农业科学院林果花卉研究所葡萄园分别在霜霉病初发期（7月5日）、盛发期（8月16日）及发病后期（9月22日）共进行3次调查，每个品种选取20个新发的枝条，每个枝条自上而下调查10个叶位相同的叶片，记录发病情况，计算平均病情指数。室内及田间病害调查分级方法按照0级：无病斑;1级：病斑面积占叶面积5%及以下;3级：病斑面积占叶面积6%～25%;5级：病斑面积占叶面积26%～50%;7级：病斑面积占叶面积51%～75%;9级：病斑面积占叶面积76%及以上进行。品种抗性评价参考刘新秀等的5级分级法[16]：免疫（I）：病情指数为0;高抗（HR）：病情指数为0.1～5.0;抗病（R）：病情指数为5.1～25.0;感病（S）：病情指数为25.1～50.0;高感（HS）：病情指数为50.1～100.0。

1.2.2 酶活性测定 将配制好的孢子囊悬浮液，采用喷雾法接种于温室盆栽葡萄苗叶片上，喷清水为对照，接种后保湿24 h。并于接种后24、48、72、96 h分别采集长势一致、相同叶龄葡萄叶片进行酶活性测定，每个处理重复3次。所采集样品迅速放入液氮中速冻0.5 h后，置于-40 ℃冰箱中保存备用。

POD、PPO、PAL、CAT活性测定用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒进行，具体操作按试剂盒说明书进行。POD活性以1 g组织在反应体系中1 min使470 nm处的吸光度变化0.01，定义为1个酶活性单位;PPO活性以1 min 1 g组织在反应体系中使525 nm处的吸光度变化0.01，定义为 1个酶活性单位;PAL活性以1 g组织在反应体系中1 h使 290 nm 下吸光度变化0.1，定义为1个酶活性单位;CAT活性以 1 g 组织在反应体系中1 min使240 nm下吸光度变化01，定义为1个酶活性单位。

1.3 数据分析

试验数据用Excel 2003进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同葡萄品种对霜霉病的抗性评价

通过室内离体接种结合田间自然发病调查，根据病情指数进行葡萄抗病性评价结果如表1所示，高妻、夏黑对霜霉病表现为抗病（R），红地球对霜霉病表现为感病（S），瑞必尔表现为高感（HS）。各品种在室内接种条件下病情指数均高于田间自然发病的病情指数。因为室内离体接种所提供的环境

2.2 不同葡萄品种酶活性测定结果

2.2.1 不同品种PPO活性测定结果 接种霜霉病菌后各品种PPO活性变化见图1。与对照相比，各品种活性均有明显提高，且不同品种之间存在差异。抗性品种接种后酶活性迅速升高，且在48、96 h出现2个酶活性高峰，活性维持时间较长;感病和高感品种接种后酶活性变化较为缓慢，且只在72 h出现了1个酶活性高峰，随后迅速下降。整个测试期间PPO活性表现为抗性品种﹥感病品种﹥高感品种。

2.2.2 不同葡萄品种POD活性测定结果 接种霜霉病菌后各品种POD活性变化见图2。各品种酶活性与对照相比均有明显提高，且不同品种酶活性变化情况不同。抗性品种接种后酶活性升高速度快，且在48、96 h出现2个酶活性高峰，活性维持时间较长;感病和高感品种接种后酶活性缓慢增加，且只在72 h出现了1个小的酶活性高峰，随后迅速下降，高感品种下降速度更快。整个测试期间抗性品种PPO活性维持在较高的水平。

2.2.3 不同葡萄品种CAT活性测定结果 接种霜霉病菌后各品种CAT活性变化见图3。各品种酶活性与对照相比均有明显提高，且不同品种酶活性变化不同。抗性品种接种后酶活性升高速度快，且在48、96 h时出现2个酶活性高峰，活性维持时间较长;感病和高感品种接种后酶活性缓慢增加，酶活性出现高峰的时间（72 h）较抗性品种晚，随后迅速下降。 24～120 h内抗性品种较感病和高感品种CAT活性长时间维持在更高的水平。

2.2.4 不同葡萄品种PAL活性测定结果 不同品种接种霜霉病菌后PAL活性变化见图4，各品种酶活性与对照相比均有明显提高，且不同抗性品种酶活性变化不同。抗性品种接种后酶活性升高速度快，且在48、96 h时出现2个酶活性高峰，活性维持时间较长;感病品种接种后酶活性缓慢增加，且只在72 h出现了1个酶活性高峰， 随后迅速下降， 高感品种

下降速度更快。整个测试期间抗性品种PAL活性维持在较高的水平。

3 结论与讨论

通过不同抗性水平4个葡萄品种受葡萄生单轴霉菌侵染后PPO、POD、CAT及PAL这4种酶活性的变化可以看出，不同抗性品种受葡萄生单轴霉菌侵染后POD、PPO、PAL和CAT活性与对照相比均明显提高，抗病品种酶活性较感病和高感品种上升快且维持在较高活性水平，酶活性均出现2个高峰，第1个酶活性高峰较感病和高感品種出现得早;抗病品种CAT和PAL较感病品种活性上升幅度更大，维持时间更长，这与许多学者的研究结果[17-20]一致。

植物与病原物长期协同进化过程中，植物形成了一系列复杂的防御机制抵御病原物的入侵。植物对病原物侵入的生理反应是以酶的催化活动实现的。植物体内的POD、CAT、PPO、PAL等防御酶都与抗病性有关[21-22]。其中，POD、CAT共同组成一个防御体系，能有效清除植物体内的自由基和过氧化物[23]。PAL是莽草酸途径的关键性酶，是酚代谢的主要酶之一，它的活性与酚类化合物的合成密切相关。酚的代谢产物被证实是潜在的抗病因子。酚被氧化产生活性很高的醌，而醌对病菌是有毒的。多酚的氧化与PPO和POD有关，PPO和POD活性大幅度提高可以大大增加酚氧化物的含量。另外，PPO、POD和PAL参与了木质素的合成，尤其是PPO和POD。一方面细胞壁的高度木质化对病菌的侵染和扩展有一定的限制作用。另一方面木质素对病菌是有毒的，葡萄抗霜霉病品种中PPO、POD活性增加，促进了木质素的合成，增加了其防御功能。受病原菌侵染后酶活性迅速升高且抗性品种升高的幅度大于感病品种，从而表现对病害的抗性。因此，抗性组合中寄主受病原菌侵染后迅速产生足够量的酚类化合物及木质素，从而产生过敏性反应，杀死病菌，起到抗病的作用。感病组合不能产生足够量的酚类化合物，因此无过敏性反应产生，不能杀死病菌。

本试验酶活性测定结果表明，葡萄叶片受到葡萄生单轴霉菌侵染后，PPO、POD、PAL及CAT活性增加在抗性品种中均明显高于感病和高感品种。尽管如此，也有一些观点认为酚类物质的积累和酚氧化物活性的增加与植物抗病反应无联系。不同的酶系在不同的寄主-病原物互作中的作用是有差异的，而且在不同的寄主与病原物组合中，同一种酶活性变化也不一致。因此，一种酶在抗病中的作用应根据具体情况具体分析，不能一概而论。

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