植物酯酶反应活性影响条件研究
摘要 研究酶液用量、pH值、温度、乙酸-1-萘酯用量等条件对酶促反应影响以及几种金属离子对酶促反应活性的影响，并建立酶抑制方程。结果表明：酶液用量0.25 mL、乙酸-1-萘酯0.6 mL、pH值6.5、温度38 ℃为酶促反应的最佳条件。Cu2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+、Co2+ 等离子在一定浓度范围内对酶促反应活性具有激活作用，且Cu2+浓度为0.06 mol/L时激活作用最为明显，能提高60.37%。Co2+浓度为0.04 mol/L时次之，能提高51.75%。
关键词 最佳条件；酶促反应；金属离子；活性
中图分类号 TS201.25 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）16-0280-02
Abstract The paper researched on the effects of enzyme dosage，pH value，temperature of reaction，aceticacid 1-naphthyl acetate dosage，on enzymatic reaction，studied the impact of several metal ions on the activity of the enzymatic reaction，established equation of enzyme inhibition. The results showed that 0.25 mL amount of enzyme dosage，0.6 mL amount of acetic acid 1-naphthyl acetate，pH value 6.5，temperature 38 ℃ were optimum conditions of the enzymatic reaction. Cu2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+、Co2+ and other inorganic metal ions have excitation effects on the catalytic activity of the enzymatic reaction within a certain range of concentration，and the effects 0.06 mol/L concentration of Cu2+ was the most obvious，it could increase 60.37%. And 0.04 mol/L concentration of Co2+ was second，it could increase 51.75%.
Key words ptimum conditions；enzymatic reaction；metal ions；activity
随着社会的发展，人们的健康意识日益增强，对食品安全越来越重视，蔬菜水果农药残留问题也备受人们的关注。目前，检测蔬菜水果中农药残留的方法有多种，例如免疫学技术、纳米金技术、酶生物传感器法、气相色谱法和乙酰胆碱酯酶法等[1-5]，但普遍存在操作不方便、价格昂贵和不利于现场操作等缺点。而植物酯酶抑制法因其价格便宜、操作简便等被广泛使用，但采用植物酯酶抑制法也存在灵敏度不好的缺点。
该文在研究酶液用量、pH值、温度等条件对酶促反应影响的基础上，深入研究Cu2+、K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Co2+、Zn2+、Na+等金属离子对植物酯酶反应活性的影响[6-8]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验仪器主要有722型光栅分光光度计，上海分析仪器厂生产；HHD-2水浴恒温锅，上海谷宁仪器厂；TH2-320恒温振荡器，上海精宏实验设备有限公司；粉碎机；DT5-1低速离心机；试验试剂主要有植物酯酶液、1-萘酚、乙酸-1-萘酯、固蓝B盐、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、SDS（十二烷基磺酸钠）、硫酸钴、硫酸钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化钠、氢氧化钠、硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸锌、氯化钙，以上试剂均为分析纯。
1.2 试验原理
植物酯酶可以使乙酸-1-萘酯水解为1-萘酚和乙酸，1-萘酚与固蓝B盐反应生成紫红色偶氮类化合物。
有机磷农药会抑制植物酯酶的活性，当有机磷农药存在时，植物酯酶活性下降，与乙酸-1-萘酯反应程度减小，显色反应产生的紫红色偶氮类化合物含量减少，颜色变浅，当农药含量较大时，溶液变为无色。部分金属离子可增强酶的催化活性，以提高检测的灵敏度与时间。
1.3 试验方法
1.3.1 1-萘酚标准曲线的绘制。用3 mL不同浓度的1-萘酚溶液加入固蓝B 盐溶液与SDS溶液混合均匀，在30 ℃水浴中反应5 min，在595 nm测定吸光度。以浓度为横坐标，以595 nm吸光度为纵坐标，作图得到标准曲线[9]，求其斜率k。
1.3.2 植物酯酶活力测定。移取0.25 mL稀释5倍的植物酯酶液，加入磷酸缓冲液4.25、0.25 mL乙酸-1-萘酯溶液，于恒温水浴锅定时反应5 min，然后加入SDS水溶液0.25 mL终止反应，再加入固兰B盐溶液0.6 mL显色，混匀1 min后，在595 nm处测定溶液吸光度[10]。参比溶液：按照试验方法以二次蒸馏水代替酶溶液。
1.4 试验过程
1.4.1 酶促反应最佳条件。分别以pH值、温度、酶液用量、乙酸-1-萘酯用量为变量进行试验，确定酶促反应的最佳条件。如测定不同pH值对酶促反应的影响时，取6支10 mL比色管编号。分别向比色管加入pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的缓冲溶液4.25 mL，加入0.25 mL稀释5倍的植物酯酶液、0.25 mL乙酸-1-萘酯溶液，于恒温水浴锅定时反应5 min，然后加入0.25 mL SDS水溶液终止反应，再加入0.6 mL的固兰B盐溶液显色，混匀1 min后，在595 nm处测定溶液吸光度。参比溶液：按照试验方法以二次蒸馏水代替酶溶液。温度、酶液用量、乙酸-1-萘酯用量、固蓝B盐用量等条件对酶促反应的影响与pH值对酶促反应的影响测定方法类似。
1.4.2 不同浓度金属离子对植物酯酶反应活性的影响。为测定不同浓度金属离子对植物酯酶反应活性的影响，分别选用Cu2+、K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Co2+、Zn2+、Na+等金属离子进行研究。如测定不同浓度Cu2+对植物酯酶反应活性的影响时，取7支10 mL比色管编号。向1号比色管加入二次蒸馏水2 mL，2～7号比色管分别加入0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol/L的Cu2+ 2 mL。再向1～7号试管加入0.25 mL稀释5倍的植物酯酶液，磷酸缓冲液4.25 mL、乙酸-1-萘酯溶液0.25 mL，于恒温水浴锅定时反应5 min，然后加入SDS水溶液0.25 mL终止反应，再加入固蓝B盐溶液0.6 mL显色，混匀1min后，在595 nm处测定溶液吸光度。K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Co2+、Zn2+、Na+等金属离子对植物酯酶反应活性的影响同Cu2+植物酯酶反应活性的影响测定方法相同。
1.4.3 有机磷农药对植物酯酶反应活性的抑制方程的建立。为了建立有机磷农药对植物酯酶反应活性的抑制方程，分别选用氧乐果、敌敌畏、甲胺磷、久效磷、马拉硫磷、敌百虫等几种常用有机磷农药进行试验研究。如建立氧乐果农药对植物酯酶反应活性的抑制方程，在最佳的试验条件下，把氧乐果农药配成一系列不同浓度的水溶液，按照1.4.2的试验方法测定不同浓度农药下的吸光度，求植物酯酶反应活性。以农药浓度负对数为横坐标、抑制率为纵坐标，建立酶抑制反应方程曲线。
2 结果与分析
2.1 pH值对酶促反应的影响
从图1可以看出，在一定pH值范围内，酶促反应活性随着pH值的升高而升高，当pH值为6.5时，酶促反应活性达到最大。pH值大于6.5时，酶促反应活性随着pH值升高而降低。故酶促反应的最佳pH值为6.5。
2.2 温度对酶促反应的影响
从图2可以看出，在一定温度范围内，酶促反应活性随着温度的升高而升高，当温度为38 ℃时，酶促反应活性达到最大。温度大于38 ℃时，酶促反应活性随着温度升高而降低。故酶促反应的最适温度为38 ℃。
2.3 酶液用量对酶促反应的影响
从图3可以看出，酶促反应活性随着酶液用量的增加而升高，当酶液用量从0.25 mL变为0.30 mL时，酶促反应活性的变化率最大。故酶促反应的最适酶液用量为0.25 mL。
2.4 乙酸-1-萘酯用量对酶促反应的影响
从图4可以看出，酶促反应活性随着乙酸-1-萘酯用量的增加而升高，当乙酸-1-萘酯用量为0.6 mL时，酶促反应活性达到最大。当乙酸-1-萘酯用量大于0.6 mL时，酶促反应活性随着乙酸-1-萘酯用量的增加而降低。故乙酸-1-萘酯最佳用量为0.6 mL。
2.5 不同浓度金属离子对植物酯酶反应活性的影响
试验测定9种不同金属离子在不同浓度下对植物酯酶反应活性的影响，结果如表1所示。
从表1可以看出，不同金属离子对酶促反应的活性有不同的影响，同一种金属在不同浓度时对酶促反应活性也有不同的影响。在不加金属离子时，酶促反应的活性为4.87 U/mL，而金属离子的存在使得酶促反应活性改变。Zn2+、Na+、Mg2+、K+ 4种离子的存在会使酶促反应活性降低。Cu2+、Mn2+、Ca2+ 3种离子对酶促反应活性的影响，需根据金属离子的浓度来判断。Fe2+、Co2+ 2种离子在试验浓度范围内对酶促反应活性有激活作用。
Cu2+、Mn2+、Ca2+ 3种离子对酶促反应活性具有两重性。当浓度为0.04～0.08 mol/L时，Cu2+、Mn2+、Ca2+ 3种离子对酶促反应活性具有激活作用，且当Cu2+浓度为0.06 mol/L、Mn2+浓度为0.04 mol/L、Ca2+浓度为0.06 mol/L时，激活作用达到最大，分别使酶促反应活性提高60.37%、45.99%和36.55%。
Fe2+、Co2+ 2种离子在试验浓度范围内对酶促反应活性有激活作用，且当Fe2+、Co2+浓度为0.04 mol/L，激活作用最为明显，分别使酶促反应活性提高50.31%和51.75%。
2.6 有机磷农药对植物酯酶反应活性的抑制方程
分别选用氧乐果、敌敌畏、甲胺磷、久效磷、马拉硫磷、敌百虫等几种常用有机磷农药进行研究试验，建立相应的抑制方程，结果如表2所示。
从表2可以看出，敌敌畏、甲胺磷、久效磷、马拉硫磷、氧乐果、敌百虫的最低检出限分别为0.045、0.045、0.025、0.030、0.100、0.020 mg/kg。
3 结论与讨论
试验表明，酶促反应的最佳条件：移取稀释5倍的植物酯酶液0.25 mL，加入pH值为6.5的磷酸缓冲液4.25 mL、乙酸-1-萘酯溶液0.6 mL，于恒温水浴锅定时反应5 min，然后加入SDS水溶液0.25 mL终止反应，再加入固兰B盐溶液0.6 mL混合显色1 min。
Zn2+、Na+、Mg2+、K+ 4种离子无论浓度多大，它们的存在会使酶促反应活性降低。Cu2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+、Co2+ 等离子在一定浓度范围内对酶促反应活性具有激活作用，且Cu2+浓度为0.06 mol/L时激活作用最为明显，能提高60.37%。Co2+浓度为0.04 mol/L时次之，能提高51.75%。
4 参考文献
[1] 王亮，潘琇，徐婉莉，等.食品农药残留快速检测技术研究进展[J].食品科技，2005（10）：74-77.
[2] 王向红，崔小军，李昕，等.食品中有机磷农药检测方法研究进展[J].食品研究与开发，2006，27（6）：190-194.
[3] 翁霞，孟玲，刘长江.用于农药残留测定的植物酯酶的反应条件[J].农药，2006，45（6）：394-396.
[4] 董超.采用植物酯酶测定农药残留的研究[J].农药，2001（9）：19-20.
[5] 刘彦钊，冯红军，席会平，等.Co2+对植物酯酶法测定蔬果农药残留的活化作用的研究[J].济源职业技术学院学报，2009（6）：54-58.
[6] 王吉中，冯欣，王丽娟.不同金属离子对米糠解脂酶活性影响研究[J]，现代食品科学，2008（6）：74-23.
[7] 薛超彬，王勤，贺量，等.2005.金属离子对菜青虫酚氧化酶活力的影响[J].厦门大学学报：自然科学版，2005（S1）：120-122.
[8] 彭维，欧爱芬.金属离子对酶活性影响研究[J].酿酒，2013（1）：60-62.
[9] 许学勤，徐斐，华泽钊.用于有机磷农药残留快速检测的固定化小麦酯酶研究[J].食品科学，2003，24（5）：122-126.
[10] 刘春红，刘志彪.以α-乙酸萘酯为底物植物酯酶活力测定条件的优化[J].食品工业科技，2013（6）：145-147，151.
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