分子遗传学技术在多结节肺癌诊断中的应用现状
杨猛哲 杨政鸿 陈雪静 陈姣 周永春
国家癌症中心最新数据表明，肺癌发病率和死亡率为20.37%和26.8%，是新发和死亡人数最多的癌种［1］。随着“早筛早诊早治”项目的普及和低密度螺旋CT 的广泛应用，多结节肺癌的检出率日益增加。多结节肺癌主要分为多原发肺癌（multiple primary lung cancer，MPLC）和肺内转移癌（intrapulmonary metastasis，IM），不同分型的患者首选的治疗方案及预后效果差异化明显，明确患者是否为MPLC 是个体化精准治疗的关键。近年来不断有学者利用分子遗传学特征对MPLC 进行诊断，但目前仍没有确切的分子标记。本文探讨了分子遗传学技术在MPLC 诊断中的应用现状。
MPLC 是一种肺部有两个或两个以上原发肺癌病灶的罕见肺癌分型，占新诊断肺癌的18%，其发病率在0.3%～7%之间［2-3］。MPLC 可分为同时性多原发肺癌（synchronous multiple primary lung cancer，sMPLC）和异时性多原发肺癌（metachronous multiple primary lung cancer，mMPLC）［4］。1975年由Martini 和Melamed 首次提出了MPLC 的诊断标准［5］：
①sMPLC 诊断标准：A 结节独立且相距较远；
B 组织学：1）结节组织类型不同；
2）结节组织类型相同，但位于不同的肺段、肺叶或者双侧肺且同时满足以下条件：a.不同起源的原位癌；
b.共同的区域淋巴结无癌细胞转移；
c.确诊时无远处转移。
②mMPLC 诊断标准：A 结节组织类型不同；
B 结节组织类型相同，满足以下任一条：a.无瘤间隔期≥2年；
b.起源于不同的原位癌；
c.结节位于不同的肺叶或肺，且共同的区域淋巴结无癌细胞转移，确诊时无远处转移。
M&M 标准诊断MPLC 的要点在于肺结节间的组织形态特征是否一致，其在临床应用中也被不断修改补充，2003年美国胸科医师协会（American College of Chest Physicians，ACCP）将mMPLC的诊断时间更新为无瘤间隔期≥4年［6］；
2013年ACCP 指南提出可以通过分子遗传学特征来鉴别多发肺癌的克隆性起源［7］。但目前仍没有诊断MPLC 确切的分子标记。因此，利用分子遗传学技术寻找MPLC 的分子标记也是当下研究的热点。
传统的M＆M 标准和ACCP 指南都是基于医师的经验对肺癌组织病理学进行判断，缺乏分子遗传学的客观依据。分子遗传学技术可通过检测样本中遗传物质的改变反映机体的状况，对疾病的诊断、治疗等方面具有非常重要的价值。诊断MPLC 的分子遗传学特征主要有基因拷贝数改变［8］、杂合性缺失［9］和基因突变［10］等。
2.1 微阵列比较基因组杂交技术
微阵列比较基因组杂交技术［11-12］（array comparative genomic hybirdization，aCGH）是一种高通量基因组检测技术，少量DNA 就能检测肿瘤在不同时期的拷贝数改变（copy number variations，CNVs），既可以对受检者所有基因进行全面筛查，也能够识别特征性的CNVs 并提供精确的基因定位，具有高灵敏度、高精确度、高分辨率的优点。Girard N 等结果表明［13］利用aCGH 对全基因组CNVs 分析和多个位点的突变检查有助于区分MPLC 和IM。Vincenten 等［14］利用aCGH 对90 名多结节肺癌患者的139 对标本进行全基因组CNVs 分析以诊断MPLC 或IM，尽管组织学比较与aCGH 结果存在差异，但更倾向通过分子检测确定第二肿瘤的起源。然而，想将aCGH 广泛应用于临床还具有以下的局限性［13-14］：①aCGH 要求使用新鲜冷冻的组织，因此对异时性肿瘤标本的储存条件要求更高。②aCGH 要求样本中含有足够数量的肿瘤细胞，这对标本取材和组织处理具有极高的要求。③aCGH 费用昂贵且检测周期长。④没有标准化的自动统计分析的软件。
2.2 微卫星标记分析
微卫星标记分析（microsatellite analysis，MSA）是对均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，即有1～6 个核苷酸的串联重复片段进行分析。微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）和杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）是微卫星变异的两种主要表现特征。LOH 在MPLC 诊断的应用中相对广泛。Wang 等［15］对30 名多结节肺癌患者的70 个肿瘤标本进行克隆性起源的鉴别，不仅对6 个多态性DNA 标记D3S1766（3p14～21）、D4S408（4q33～34）、IFNA（9p21）、D9S171（9p21）、D11S970（11q13）、TP53（17p13.1）进行分析，还检测了TP53 的突变以及X 染色体的失活情况。MSA 结果显示只有患者17、18、27、29 结节间的LOH 不完全相同，即使结节间都有相同位点的LOH，但某些结节LOH 位点更多；
此外，只有患者4、5 结节间的TP53 突变情况不完全一致，仅患者1 结节间的X 染色体失活模式不同，综合三种检测结果得出患者1、4、5、17、18、27、29 可诊断为MPLC，其余患者均应考虑IM。有文献报道［9］一患者CT 显示双肺有10个以上肺结节，怀疑IM。Huang 等［16］的研究也表明肺部原发肿瘤与其转移瘤之间具有高度一致的LOH 模式，相对于组织形态学分析更推荐检测LOH 作为鉴别肿瘤克隆性起源的方法。
2.3 下一代测序技术
下一代测序技术（Next Generation Sequencing Technology，NGS）又称大规模并行测序技术，已广泛应用于临床实验室的分子检测中。Eguren S等［17］通过NGS 对同一患者右肺上叶、左肺上叶、左肺下叶的三个结节进行50 个靶向基因检测，结果显示右上叶结节TP53 c.659A＞G、KRAS 野生型，左上叶结节TP53 c.725G＞T、KRAS c.34G＞T，左下叶结节TP53 c.1024G＞T、KRAS c.35G＞T，由于转移性肿瘤不会发生明显的基因型改变，而三个结节的突变位点各不相同，因此确定这名患者的三个结节为MPLC。Pei 等［18］利用NGS 对30 名患者的67 个肺癌结节进行808 个基因的检测，筛选出了EGFR、KRAS、BRAF、ERBB2、ALK、ROS1、MET 和RET 八个高频驱动基因，基于EGFR L858R 在MPLC 和IM 中的发生几率一致，对MPLC 和IM 进行了重新鉴别并制定了一个鉴别模式，见图1。Liu 等［19］通过NGS 对三名患者进行520 个肺癌高频驱动基因检测，对三名患者肺癌的克隆性起源进行判定，使得患有IM 的病人得到及时的靶向治疗。与传统测序技术相比，NGS 可同时完成多种遗传突变的检测，具有分辨率高、灵敏度高、输入DNA 样本更少、缩短时间和节约经济成本等优点。这也要求我们要持续探索MPLC 的驱动基因，不断加深对MPLC 的认识。
图1 多原发肺癌诊断模式Figure 1 The diagnostic model of multiple primary lung cancer
2.4 全外显子测序技术
全外显子测序（whole-exome sequencing，WES）是定向捕获基因组中外显子区域并进行高通量测序。WES 的优势主要在于广泛地覆盖编码区肿瘤DNA 的变化，完成等位基因突变片段的深度测序和稀有突变的敏感检测。Bai 等［20］对一患者病理诊断为肺鳞癌和肺腺癌的两个手术标本送WES，结果显示肺鳞癌的突变频率高于肺腺癌。两个肿瘤虽然位于相同肺叶，具有相同的遗传背景，但每个肿瘤有各自的起源和克隆进化，最终形成不同的表型。Corsini 等［21］对4 名多结节肺癌患者的10 个肿瘤样本进行WES，根据ACCP 指南4 名患者均判定为IM，而测序结果表明患者1、2、4 的肿瘤样本间共享至少20%的相同突变，患者3 的三个肿瘤结节即使有相同的遗传背景和暴露史，但表现出不同的基因组特征，因此患者3 更有可能诊断为MPLC，患者1、2、4 为IM。Xue 等［22］将12 名病理诊断为肺转移癌的食道和肺双鳞状细胞癌患者的40 个肿瘤标本进行WES，结果显示5 名患者肿瘤标本间基因组特征差异明显，提示为MPLC，其他7 名患者肿瘤标本共享基因谱特征，应诊断为IM。相对于NGS，WES 集覆盖深度更深、灵敏度更高、变异检测更准确等优势与一体，但WES 对检测样本的要求更高，穿刺活检标本或胸腔积液的细胞学标本多因肿瘤细胞占比较少导致样本不合格率偏高，这也是WES 的样本局限性［23］。
2.5 全基因组测序技术
全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）是基于一种能够快速大量对DNA 进行检测的二代测序技术，对整个基因组序列进行测序，能够获取完整的基因组信息。目前WGS 对于多结节肺癌克隆性起源的研究并不多见，有学者［14］针对染色体拷贝数变异（CNA）模式对于肿瘤具有高度特异性这一特征研究了全基因组CNA 模式在多结节肺癌克隆性起源鉴别中的作用。Vincenten 等收集了139 对肺癌标本，分别对其进行CNA检测、组织形态学分类以及按M&M 标准和ACCP-2013指南进行分类。CNA 的结果显示74 对标本具有克隆性考虑为转移性肿瘤，33 对不具有克隆性考虑为多原发肿瘤，另外32 对不确定。139 对标本中有130对发现了组织学相似性，M&M 分类和ACCP-2013指南适用于34 对肿瘤，这与CNA 结果的一致性分别为69%、50%和63%。根据病人预后随访判定79对肿瘤为转移性疾病，36 对肿瘤为非转移性疾病，24 对肿瘤因死亡或随访缺失被排除在外。CNA 诊断、组织学推断、M&M 标准、ACCP-2013 指南与随访确诊MPLC 和IM 的一致性分别为70%、71%、67%、67%和70%、71%、67%、67%。综合分析WES在确定多结节肺癌的克隆性起源中具有更高的准确性。WGS 得到的数据量更大，且测序覆盖深度均一。但由于人类致病突变的85%都在外显子区，而外显子区只占人类基因组的1%，因此WGS 检测到的大部分突变意义是未知的。WGS 的高成本也使得其在临床中的应用没有WES或NGS广泛。
准确诊断MPLC 是个体精准化治疗的关键，而基于肿瘤异质性这一特征［24］，分子遗传学技术对MPLC 的诊断提供了新的策略，不同的分子遗传学技术都有各自的优缺点，其中WES 能够覆盖全部蛋白质编码区，具有较深的测序深度和较高的灵敏度，已有研究明确其在前列腺癌［25］、肝细胞癌［26］、甲状腺癌［27］和结直肠癌［28］中具有鉴别多发结节克隆性起源的作用，在关于MPLC 致病突变不明确的情况下，WES 在诊断MPLC 时基因组检测覆盖相对全面且具有意义。但对于MPLC 的基因组学仍需要不断研究探索。
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