GPR50,在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位
王 甜，黄显朋，朱洪阳，吉文汇，2，付 伟，2，殷 实，2，兰道亮，2
(1.西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041；
2.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川 成都 610041)
G 蛋白偶联受体(GPCRs)，也称为7 次跨越蛋白(7TM)，是最丰富的细胞膜受体之一，具有约800 个成员.GPCR 不仅能与同聚体互作，也能与异聚体相互作用[1]，介导了机体内80%的跨膜信号转导.迄今为止，大约100 个GPCRs 未鉴定出其内源配体，被称为孤儿GPCR.G 蛋白偶联受体50(GPR50)作为一种孤儿GPCR，被证明与褪黑素(melatonin，MT)受体MT1和MT2具有高度同源性[2]，因此也被称为褪黑素相关受体.虽然不与褪黑素结合，但GPR50 可与MT1及MT2形成异二聚体，并通过影响MT1介导的相关信号通路而发挥作用[3].GPR50 受体具有七个疏水段和一个亲水性羧基尾，其显著特征是氨基末端和额外的细胞环中没有N-连接的糖基化共有位点，同时具有一个含有三个多态性位点的C 端长链.GPR50 被证实在小鼠和兔等动物的多个器官和组织中表达，尤其在脑和生殖器官中表达量较高[4].GPR50 参与糖皮质激素受体(GR)信号通路、瘦素(leptin)信号通路、NOGO-A 及RhoA/ROCK 信号通路等多条通路，其生理功能受到广泛关注.据报道，GPR50 与双相情感障碍、脂质代谢、产热、脂肪生成和神经元发育有关[5]，也被认为是抑郁症等精神疾病治疗的重要靶点[6].在最新的研究中，Y.Chen[7]等人发现GPR50 具有促进牦牛卵母细胞成熟的潜在作用，但GPR50 是否在哺乳动物卵母细胞成熟发挥作用还有待证明.
哺乳动物卵母细胞的成熟涉及多个细胞事件，包括生发泡破裂(GVBD)、染色体凝聚、纺锤体的形成和迁移[8].据报道，参与卵母细胞成熟的分子通路主要有Ca2＋信号通路[9]、MAPK 信号通路[10]、Sirt1 -Nrf2 -Cyclin B1 信号通路[11]、SUMO 通路[12]等，解析哺乳动物卵母细胞成熟的分子机制成为近年来研究的热点.为研究GPR50 在小鼠卵母细胞体外成熟过程中的分子机制，利用qPCR 及免疫荧光技术研究GPR50 在小鼠卵母细胞发育过程中的动态表达规律及亚细胞定位，为研究GPR50 在小鼠卵母细胞体外成熟中的作用奠定基础，同时也为丰富哺乳动物卵母细胞成熟的分子机制提供依据.
1.1 材料
本试验所用小鼠(Mus musculus)均为6 ～8 周龄无特定病原体(SPF)级别的ICR 小鼠，购自成都达硕实验动物有限公司.所用牦牛卵巢由成都青白江屠宰场提供，兔卵巢和鸡卵巢由西南民族大学畜牧兽医学院兰道亮课题组提供.
1.2 方法
1.2.1 小鼠卵母细胞的收集与培养
经腹腔注射10 IU 孕马血清促性腺激素(PMSG)44 ～48 h 后，用脱臼法处死小鼠并取卵巢置于37 ℃预热的、含1%青链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)中.在体式显微镜下用1 mL 注射器扎破卵泡，使小鼠卵巢内容物流出.收集生发泡(GV)时期卵母细胞，将其置于预热2 h 的成熟培养液中进行培养.成熟培养液用培养用油覆盖，其配方为:M2 培养液、10 IU/mL 促卵泡激 素(FSH)、 10 IU/mL 黄 体 生 成 素(LH)、20 μg/mL雌二醇(E2)、10%胎牛血清(FBS)、1%双抗.分别在培养0、4、8、14 h 收集GV、GVBD、第一次减数分裂(MI)及第二次减数分裂(MII)期卵母细胞.裸卵清洗后直接用于后续实验或保存至-80 ℃，卵丘-卵母细胞复合物置于0.2%的透明质酸酶中于37 ℃消化3 ～5 min，除去颗粒细胞后用于后续实验或保存至-80 ℃.
1.2.2 引物的设计和合成
在GenBank 下载小鼠(Mus musculus)的GPR50(NM_010340.2)、GAPDH(NM_008084.3)基因序列，用Primer Premier 5 设计引物，引物序列如表1 所示.6对引物均由上海生工生物工程有限公司合成.
表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information
1.2.3 总RNA 的提取、反转录和PCR
使用Omega E. Z. N. A © MicroElute Total RNA Kit 提取各时期小鼠卵母细胞的总RNA，再利用Exon-Script RT SuperMix with dsDNase 进行反转录，体系为Total RNA 13 μL、5 ×Reaction Mix*4 4 μL、Supreme Enzyme Mix 3 μL，反应程序为25 ℃10 min，55 ℃15 min，85 ℃5 min.普通PCR 体系为2×Taq Advanced PCR Master Mix 12.5 μL、Forward Primer 0.5 μL、Reverse Primer 0.5 μL、ddH2O 9.5 μL、cDNA 2 uL，反应程序为94 ℃3 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s、70 ℃30 s/kb (25 ～35 cycles)，70 ℃5 min.
1.2.4 qPCR 体系的建立及优化
qPCR 的初始反应体系为2 × Fast SYBR Green qPCR Master Mix UDG 10 μL、10 μM Forward Primer 0.4 μL、10 μM Reverse Primer 0.4 μL、cDNA 2 μL、PCR-grade Water 7.2μL，反应程序为50 ℃2 min、94 ℃10 min、95 ℃3 min、95 ℃5 s、60 ℃30 s(40 cycles).用不同的引物进行普通PCR，选出最佳的引物；
以最佳引物为基础，在不同引物浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μM)进行qPCR，找到最佳的引物浓度，以此优化所建立的qPCR 反应体系和程序.
1.2.5 标准曲线的绘制
以小鼠GV 期卵母细胞的cDNA 为模板，将其以10 倍比稀释并用100～10-45 个浓度以1.2.4 得到的方法进行qPCR. 记录各个浓度的Ct 值，以cDNA 浓度为横坐标，Ct 值为纵坐标，绘制标准曲线，分析模板浓度与Ct 值的线性关系.
1.2.6 敏感性的测定
以GV 期卵母细胞的cDNA 为模板，将100～10-56 个浓度的cDNA 分别进行qPCR 和普通PCR. 比较两种方法的最低检测稀释度，以评估所建立方法的敏感性.
1.2.7 特异性的测定
分别提取GV 期小鼠、牦牛、鸡及兔卵母细胞RNA，反转录后进行qPCR 检测各样本的GPR50 表达情况，以评估该方法的特异性.
1.2.8 重复性的测定
以3 组GV 期小鼠卵母细胞的cDNA 为模板进行qPCR，分别进行3 次组内重复和组间重复，记录样品对应的Ct 值.组内重复性是指各个样品的平均值、标准差和变异系数，组间重复是指3 个样品间的平均值、标准差和变异系数. 通过对组内重复性和组间重复性的分析，评估该方法的重复性.
1.2.9 qPCR 检测GPR50 在小鼠卵母细胞的动态表达
利用1.2.3 的方法提取小鼠各时期卵母细胞的总RNA，并将其反转录为cDNA，利用优化后的qPCR方法，测定GPR50 在小鼠卵母细胞减数分裂4 个阶段的动态表达.
1.2.10 GPR50 在小鼠卵母细胞的免疫荧光染色
将各时期卵母细胞置于固定液中固定30 min，清洗3 次后在透膜液中透膜20 min；
用含1%牛血清蛋白(BSA)的PBS 中清洗3 次后，将卵母细胞转移至封闭液中封闭15 min；
清洗后将卵母细胞转移至GPR50 Polyclonal antibody(1∶250)中，4 ℃孵育过夜；
洗涤卵母细胞3 次，将其转移至CoraLite488 - conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H ＋L)(1∶500)中，在室温下孵育1 h.清洗卵母细胞，并将其置于DAPI 溶液中染核；
2 min 后清洗卵母细胞，并用抗荧光淬灭剂封片，整个过程在避光条件下进行.
1.2.11 数据的统计分析
使用Excel 2016 进行标准曲线线性回归分析和平均值、标准差和变异系数分析，使用Light Cycler 96软件和2-ΔΔCt法进行qPCR 数据分析，使用GraphPad Prism 9 进行单因素方差分析. 所有试验均进行3 次重复以保证数据的可靠性.
2.1 小鼠卵母细胞的收集和培养
在成熟培养液中培养0、4、8、14 h，分别得到GV、GVBD、MI 及MII 时期卵母细胞(图1).
图1 不同时期的小鼠卵母细胞(200 ×)Fig.1 Mouse oocytes at different stages(200 ×)
2.2 qPCR 体系的建立及优化
2.2.1 最优引物的筛选
用不同的引物进行普通PCR，得到6 个不同的条带(图2).由图2 可知，各条带的长度与引物对应的扩增长度一致，表明成功扩增出目的基因和管家基因.另外，不同条带的亮度表明GAPDH 和GPR50 最优引物均为第2 对.
图2 各引物PCR 结果Fig.2 PCR with each primer
2.2.2 qPCR 最优浓度的筛选
以GV 期小鼠卵母细胞cDNA 为模板，在0.1、0.2、0. 3、0. 4、0. 5 μM 五个浓度下进行qPCR. 其中，GPR50 和GAPDH 引物终浓度为0.3 μM 时Ct 值最小(表2)，且扩增曲线出峰最早、信号最强(图3、图4)，因此将0.3 μM 作为所建立荧光定量PCR 方法最佳的引物终浓度.
图3 GPR50 在不同引物终浓度条件下的扩增曲线Fig.3 Amplification curves of GPR50 using different primer concentrations
图4 GAPDH 在不同引物终浓度条件下的扩增曲线Fig.4 Amplification curves of GAPDH using different primer concentrations
表2 不同PCR 引物终浓度的Ct 值Table2 Ct values of different PCR primer concentrations
经优化后的qPCR 体系为20 μL，其中2 × Fast SYBR Green qPCR Master Mix UDG 10 μL、10 μM Forward Primer 0.6 μL、10 μM Reverse Primer 0. 6 μL、cDNA 2 μL、PCR - grade Water 6.8 μL，反应程序为50 ℃2 min、94 ℃10 min、95 ℃3 min、95 ℃5 s、60 ℃30 s(45 cycles).
2.3 标准曲线的绘制
将5 个稀释度的GV 期卵母细胞cDNA 模板进行qPCR，得到的扩增曲线和溶解曲线如图(图5).生成的溶解曲线单一，溶解温度均为88 ℃～89 ℃. 以模板浓度的对数值为横坐标，Ct 值为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程为y＝-0.856x＋28.374，其相关系数r2＝0.988，截距为28.374(图6)，说明模板浓度和Ct 值具有良好的线性关系，该方法符合预期.
图5 溶解曲线和扩增曲线Fig.5 Melting and amplification curves
图6 qPCR 的标准曲线Fig.6 Standard curve for qPCR
2.4 敏感性的测定
将6 个浓度稀释度的GV 期卵母细胞cDNA 分别进行qPCR 和普通PCR，发现qPCR 的最大检测稀释度为10-4(图7)，而普通PCR 的最大检测稀释度为100(图8)，表明所建立qPCR 方法的敏感性优于普通PCR 敏感性.
图7 溶解曲线和扩增曲线Fig.7 Melting and amplification curves
图8 普通PCR 灵敏度的测定Fig.8 General PCR sensitivity determination
2.5 特异性的测定
将兔卵母细胞、鸡卵母细胞、牦牛卵母细胞及小鼠卵母细胞的cDNA 以最优浓度的引物进行qPCR，发现只有小鼠卵母细胞的cDNA 有荧光信号(图9)，除小鼠卵母细胞以外的模板还出现非特异性扩增(图10)，证明所建立的方法特异性良好.
图9 不同模板qPCR 的扩增曲线Fig.9 Amplification curves of qPCR with different templates
图10 不同模板qPCR 的溶解曲线Fig.10 Melting curves of qPCR with different templates
2.6 重复性的测定
选择3 个不同的GV 期卵母细胞cDNA 进行3 次组间和组内重复性实验，发现扩增曲线和溶解曲线重合度较高(图11)，同时该qPCR 方法组内变异系数在0.69% ～0.82%，组间变异系数在0.10% ～0.40%(表3)，均小于1%，证明所建立的qPCR 方法重复性良好.
图11 扩增曲线和溶解曲线Fig.11 Amplification and melting curves
表3 重复性的测定Table 3 Repeatability determination
2.7 GPR50 在小鼠卵母细胞成熟过程中的动态表达
利用qPCR 技术检测GPR50 在小鼠卵母细胞中表达情况的结果表明，GPR50 在不同时期卵母细胞中均有表达. 生发泡破裂后，GPR50 表达显著增多，GVBD 期的表达量显著高于GV 期(P＜0. 05)；
而GVBD 期发生后，GPR50 的表达量缓慢升高；
卵母细胞减数分裂到达MI 后，GPR50 的表达量极显著升高，在MII 期表达量最高，显著高于GV、GVBD 及MI 期(P＜0.01)的表达量(图12).
图12 GPR50 在小鼠卵母细胞发育过程中的动态表达Fig.12 Dynamic expression of GPR50 during mouse oocyte development
2.8 GPR50 在小鼠卵母细胞成熟过程中的亚细胞定位
免疫荧光结果表明，GPR50 在小鼠卵母细胞细胞核和细胞质均有表达，且随着卵母细胞的发育，表达量不断升高，到MII 期表达量最高(图13)，与qPCR 结果保持一致.在MII 期时，GPR50 大量分布在细胞膜.
图13 GPR50 在小鼠卵母细胞GV(0 h)、GVBD(4 h)、MI(8 h)及MII(14 h)期的亚细胞定位Fig.13 Subcellular localization of GPR50 in mouse oocytes at GV (0 h)，GVBD (4 h)，MI (8 h) and MII (14 h) stages
由于RNA 易降解、小鼠卵母细胞RNA 含量低及样品收集困难等原因，利用qPCR 技术在卵母细胞或胚胎中进行基因表达检测具有一定困难.针对小鼠卵母细胞、胚胎等微量样品的基因表达测定，建立一种高效、稳定且灵敏度高的qPCR 体系尤为重要. 引物的设计是影响qPCR 质量的最关键因素之一，准确可靠的定量取决于使用有效的引物[13]. 本研究针对GPR50 和管家基因设计了多条引物，为qPCR 准确性奠定了基础.同时，对于微量mRNA 的定量，最优的敏感性和重复性分析是建立在最优引物浓度的基础上.本研究以Ct 值最低和荧光信号最强为标准，筛选的最优引物终浓度为0. 3 μM，其选择标准与M. R.Green[14]等人一致. 根据绘制的标准曲线，本研究模板浓度和Ct 值具有良好的线性关系. 本研究建立的qPCR 方法敏感性优于普通PCR 的敏感性，符合之前的研究结果[15-17].在对特异性的结果进行评估时，发现将兔卵母细胞、鸡卵母细胞及牦牛卵母细胞进行qPCR 时均无法产生信号，证明该qPCR 方法特异性良好.而对重复性进行评估时，组间变异系数和组内变异系数均小于1%，证明所建立的qPCR 方法重复性较高，可用于后续试验.
据报道，GPR50 在哺乳动物各组织中广泛表达，尤其在脑组织、生殖器官及胎盘中表达量最高[18].Grünewald E[19]等人发现，GPR50 在小鼠胚胎第13 d(E13)开始表达，到第18 d(E18)达到峰值.而在胚胎第13 d(E13)时，原始生殖细胞正处于增殖阶段，随后形成卵原细胞，之后形成原始卵泡[20].因此，GPR50在卵泡的发育过程中可能发挥着重要的作用.颗粒细胞与卵母细胞可进行cGMP 交换[21]，cGMP 进入卵母细胞后可通过影响cAMP 进而影响卵母细胞的发育[22]，该过程为原始卵泡的形成奠定了基础. GPR50作为膜蛋白受体，可能间接参与了cGMP 的扩散过程，同时与调控cGMP 的CNP -NPR2 信号通路[23]具有潜在的联系. 而目前还没有学者对GPR50 与卵泡发育的关系进行研究，具体的分子机制和信号通路还有待挖掘.根据姚颖[24]等人的研究，GPR50 基因在牦牛卵母细胞GV 期就有表达，并在成熟过程中逐渐升高，在MII 期达到顶峰，且极显著高于GV 与GVBD 期(P＜0.01). 本研究通过收集GV、GVBD、MI、MII 期的小鼠卵母细胞，利用qPCR 技术测定GPR50 在小鼠卵母细胞发育过程中的表达情况. 结果表明，GPR50在小鼠卵母细胞减数分裂各阶段均有表达，其表达量随卵母细胞的发育逐渐升高且于MII 期时达到顶峰，其表达规律与姚颖[24]等人的研究结果保持一致. 但不同的是，GV 到GVBD 进程中GPR50 表达量显著增高，GVBD 到MI 进程中GPR50 表达量缓慢升高，MI到MII 进程中表达量显著升高，这可能是小鼠和牦牛物种差异导致的结果.
本研究对GPR50 在小鼠卵母细胞发育过程的亚细胞定位研究得知，GPR50 在细胞质和细胞膜广泛表达，且随着卵母细胞的发育，GPR50 表达量逐渐升高，在成熟卵母细胞中广泛分布在细胞膜区域. 姚颖[24]等人发现，GPR50 在牦牛卵母细胞中的分布主要集中于细胞膜，且随着卵母细胞的发育逐渐向细胞质弥散分布，而在小鼠卵母细胞中，GPR50 广泛分布在细胞质和细胞膜，这可能是小鼠和牦牛物种差异导致的结果.同时，GPR50 在CA1 -3 锥体细胞、齿状回的颗粒细胞及神经元相关细胞的分布主要集中于细胞膜和细胞质[19，25]，与GPR50 在卵母细胞的亚细胞定位一致，这表明GPR50 作为膜受体蛋白在细胞信号传导过程中具有重要的作用.
本研究基于GPR50 基因和小鼠卵母细胞建立了一种准确高效的实时荧光定量PCR 方法，该方法重复性高、特异性强、灵敏度高，可用于GPR50 在小鼠各时期卵母细胞相对表达量的测定；
随着卵母细胞的发育，GPR50 在小鼠卵母细胞的表达量逐渐增高，到MII 期到达顶峰；
GPR50 主要分布于小鼠卵母细胞的细胞质和细胞膜. 本研究结果为解析GPR50 在小鼠卵母细胞减数分裂进程的分子机制提供依据.