外周血细胞因子对非小细胞肺癌的预后及免疫治疗的疗效的预测作用

梁振宇, 万启明, 彭炜惟, 沈波, 周国仁

肺癌目前作为全球发病率第二、死亡率第一的恶性肿瘤极大地威胁着人类的健康[1],其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌的85%左右。针对程序性细胞死亡受体1(programmed cell death 1,PD-1)/程序性细胞死亡配体1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)的免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)已为NSCLC的治疗领域带来深刻变革,改善了患者的预后与生活质量,但免疫治疗的有效性较低以及免疫治疗相关不良反应等问题仍待解决,探索新的免疫治疗相关生物标志物以筛选潜在获益人群,及早发现免疫相关不良反应值得探究。目前,基于肿瘤组织的PD-L1表达已广泛应用于临床并指导临床实践,但其依赖于组织样本,取材不易,较少反应机体免疫状态,且单部位单次活检不能克服肿瘤的时空特异性,存在一定局限性。而基于外周血的循环生物标志物,如循环肿瘤DNA、外周血肿瘤突变负荷[2]、循环肿瘤细胞等[3],因取材方面快捷,可于肿瘤治疗过程中多次采样动态监测,较全面反应肿瘤与机体状态等优势,显示出一定临床转化的前景,并被广泛开展了研究。

细胞因子是由免疫细胞及组织细胞分泌的可溶性小分子蛋白质,通过结合相应受体在细胞间发挥相互调控作用,调节细胞生长增殖、分化与生存,是固有免疫系统及适应性免疫系统的重要调节分子[4-5],其主要以自分泌和旁分泌的方式作用与分泌细胞自身以及邻近细胞,少数细胞因子也可释放到外周血中对远距离的靶细胞发挥作用,细胞因子在外周血中浓度较低,随着检测技术的进步,检测外周血浓度极低的细胞因子成为可能[6]。鉴于外周血细胞因子的水平及其变化可反映患者全身免疫情况,目前细胞因子在恶性肿瘤免疫治疗中的预测作用受到了更广泛的重视,研究发现在伊匹木单抗(Ipilimumab)联合化疗的小细胞肺癌患者中,基线高水平IL-8与预后不佳相关,基线高IL-2水平是保护性因素,高IL-6和TNF-α则与耐药相关[7];在黑色素瘤患者中,对免疫治疗有反应的患者的基线IFN-γ,IL-6及IL-10均高于无反应患者[8];在NSCLC患者中,有前瞻性研究表明全身炎症及促炎细胞因子谱可以预测NSCLC免疫治疗的疗效[9]。本文将盘点在NSCLC免疫治疗预测与预后方面研究较成熟的细胞因子相关临床研究,探讨其作为免疫治疗生物标志物的机制。

IL-6是一种主要的促炎细胞因子,研究发现肿瘤细胞中IL-6/JAK/STAT3信号通路的激活,通过抑制细胞凋亡、促进细胞存活、增殖、血管生成、侵袭及转移等方式,在肿瘤的发生和发展中发挥关键作用。肿瘤细胞中IL-6可激活多种促进生存的信号通路,包括抗凋亡基因Mcl-1 和细胞周期蛋白A1的上调,此外,IL-6可通过促进基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达来促进肿瘤的侵袭和转移,并且和髓源性抑制细胞MDSC的积累与活化相关[10]。肿瘤细胞及周围免疫细胞均可产生IL-6,导致外周血IL-6水平的增加,与黑色素瘤[11]、乳腺癌[12]、结肠癌[13]等多癌种的不良预后相关。一项纳入23项研究的Meta分析提示循环IL-6及C反应蛋白水平增加与NSCLC患者预后不佳相关[14]。免疫治疗方面,较高的外周血IL-6水平是三阴性乳腺癌[15]及黑色素瘤[16-17]免疫疗效不佳的独立危险因素,基线高IL-6水平与Ipilimumab治疗的小细胞癌患者的耐药相关[18]。

Kang等[19]首次证明基线IL-6水平可预测PD-1/PD-L1抑制剂疗效与生存获益,该研究纳入125例晚期NSCLC患者,根据基线外周血IL-6水平的高低分为2组(截断值为13.1 pg/ml),结果提示低IL-6水平组患者的客观缓解率(objective response rate,ORR)及疾病控制率(disease control rate,DCR)均优于高IL-6组(ORR为33.9%vs.11.1%,P=0.003,DCR为80.6%vs.34.9%,P<0.001),且2组的中位无进展生存期(median progression-free survival,mPFS)和中位生存期(median overall survival,mOS)差异均有统计学意义(P<0.05),低IL-6组和高IL-6组mPFS分别为6.3个月(95%CI:3.9～8.7)和1.9个月(95%CI:1.6～2.2),随访截止日期时,低IL-6组mOS尚未达到,高IL-6组mOS为7.4个月(95%CI:4.8～10.0),该研究证明基线的IL-6水平对免疫治疗的NSCLC患者的疗效及预后有着较好的预测价值,其他研究[9,20]也得出了类似的结果。Liu等[20]还通过体外及动物试验进一步阐述了其诱导免疫耐药的可能机制。而在另一项纳入黑色素瘤及NSCLC的研究中却发现基线血清IL-6在治疗有反应组及无反应组,差异无统计学意义(P>0.05),考虑该研究样本量较小有关。

Keegan等[21]研究纳入Nivolumab或Pembrolizumab单药治疗的47例NSCLC患者,测量基线及免疫治疗期间的外周血IL-6水平,并按照IL-6的变化幅度将人群分为3组:下降组(IL-6下降≥40%),稳定组(IL-6表达水平下降或上升不超过40%)和升高组(IL-6升高≥40%),结果提示3组人群的PFS分别为11个月(95%CI:2～上限未达到)、5个月(95%CI:3.5～上限未达到)、4个月(95%CI:2.3～上限未达到),且疾病进展(progressive disease,PD)组的患者IL-6水平更高,提示免疫治疗前后的IL-6水平的变化可预测免疫疗效及PFS;遗憾的是,该研究中基线IL-6水平与PFS未观察到有统计学相关性,且限于样本量较少等因素,在多因素Cox回归中IL-6的变化水平与PFS差异无统计学意义(P>0.05),后续需更大样本量的研究来进一步验证IL-6的预测作用。其他研究也得出了类似结果,Shi等[22]发现IL-6水平的升高与疗效(OR=0.015,95%CI:0.001～0.400,P=0.012)、PFS(HR=2.639,95%CI:1.163～5.991,P=0.020)、OS(HR=2.742,95%CI:1.063～7.074,P=0.037)不佳相关;Kauffmann-Guerrero等[9]也发现IL-6水平在免疫治疗后首次评估即进展患者中上升,提示IL-6水平的变化是潜在的免疫疗效及预后标志。

IL-8又名CXCL8,是CXC趋化因子家族的一员,最初被定义为中性粒细胞的促炎趋化因子,现已发现其有促肿瘤细胞生长增殖,促进血管生成,促进肿瘤细胞转化为间充质表型,募集免疫抑制性细胞等功能,在肿瘤的发生发展中扮演重要角色[23]。临床前及临床研究发现IL-8水平与患者的肿瘤负荷相关[24],是胰腺癌[25]、卵巢癌[26]、乳腺癌[27]等不良预后标志,与多种肿瘤的化疗与靶向治疗耐药相关[22]。例如在针对多西他赛耐药的结直肠癌[28]及骨肉瘤[29]的细胞系模型的临床前研究中发现抑制IL-8可逆其转耐药表型;通过siRNA敲低IL-8水平或者用CXCR1/2(IL-8受体)抑制剂可增强肝细胞癌对sorafenib的敏感性并减少肿瘤肝细胞数量等[30]。

目前,许多学者对血清IL-8的水平与非小细胞肺癌免疫治疗疗效及预后展开了相关研究。Kauffmann-Guerrero等[9]在一项纳入29例晚期NSCLC的前瞻性研究中发现在初始免疫治疗后即进展的患者,基线IL-8水平升高,以19.6 pg/ml为截断值划分IL-8水平为高组和低组,与低组相比,基线IL-8高组的PFS不佳(mPFS为4.0个月vs.19.7个月,P=0.03),提示基线高IL-8水平可能是免疫疗效及预后不佳的相关因素。Oyanagi等[31]在一项纳入38例晚期NSCLC患者的小样本研究中发现基线低IL-8水平与持久的临床获益(PFS≥6个月)相关。Sanmamed等[32]研究发现血清IL-8的水平及其变化与转移性黑色素瘤和NSCLC免疫治疗的疗效相关,且血清IL-8水平的早期(初次免疫治疗后2～4周)变化对免疫的疗效及总生存期有着良好的预测作用,考虑到IL-8水平与肿瘤负荷的一致性[24],外周血IL-8的水平可能在发现影像学改变前就能监测到早期肿瘤负荷的变化。该研究中 3例患者免疫治疗后出现假性进展,尽管3例患者影像学评估进展,但血清IL-8水平仍降低并保持低于基线,提示IL-8作为临床辅助判断肿瘤免疫治疗后假进展的潜在可能。Agulló-Ortuo等[33]也观察到了类似的结果,Nivolumab治疗有效的NSCLC患者当疾病进展时观察到IL-8的升高,且IL-8的水平升高与OS降低有关(HR=7.49,P=0.025)。IL-8基线水平及治疗中的变化情况有着潜在的预测价值,值得进一步探究。

IFN-γ在肿瘤中发挥多种作用,一方面IFN-γ可以刺激肿瘤浸润淋巴细胞的增殖、分化以及IFN-γ的分泌。另一方面,IFN-γ也可以促进免疫抑制性分子的产生,对效应T细胞的功能起负反馈调节作用[34]。此外,IFN-γ可诱导包括肿瘤细胞、巨噬细胞、T细胞等PD-L1的产生[35]。可见IFN-γ在肿瘤中的作用较为复杂,值得探究。

Kauffmann-Guerrero等[9]发现与首次评估疗效即进展患者相比,免疫治疗有反应的NSCLC患者基线IFN-γ水平更高(P<0.001),且基线IFN-γ水平较高患者(IFN-γ≥16.7 pg/ml)的PFS改善(mPFS为 40.0个月vs.5.86个月,P<0.001),多因素Cox回归显示IFN-γ是PFS的独立影响因素(HR=0.92,95%CI:0.86～0.97,P=0.004),较高的IFN-γ水平的患者更倾向于长期获益(PFS≥30周)(P<0.001)。而另一项研究在接受免疫治疗的40例NSCLC患者和35例胃癌患者中,却观察到了不同的结果,基线高IFN-γ的患者PFS更短(P=0.011),且IFN-γ的水平变化情况与疗效相关,有效组患者的IFN-γ水平较基线降低(P<0.001),而随着肿瘤的进展,IFN-γ水平大幅升高(P<0.01)[36]。考虑IFN-γ作用的复杂和多样性,以及研究的异质性,基线IFN-γ水平及其变化对免疫治疗的预后及预测还需进一步大样本研究来证实。

CXCL10是CXC亚家族的成员,又名γ干扰素诱导蛋白10(interferon-induced protein-10,IP10),是一种炎症趋化因子,由白细胞等多种细胞产生,其一方面可作为肿瘤浸润性T细胞及NK细胞的趋化因子抑制肿瘤生长[37];另一方面,越来越多研究表明CXCL10与多种肿瘤的迁移、侵袭、增殖、存活相关,CXCL10募集调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)等免疫抑制细胞,从而产生免疫抑制微环境,而包括NSCLC在内的多种细胞可表达CXCL10,从而趋化Tregs造成免疫抑制性微环境[38]。

一项纳入38例Nivolumab治疗的晚期NSCLC患者的研究[31]发现基线低CXCL10水平与持久的临床获益相关(PFS≥6个月),以0.81 μg/L为截断值划分高CXCL10组和低CXCL10组,低CXCL10组的中位PFS优于高CXCL10组(332个月vs.49个月,log-rankP=0.026)。另一项研究[39]也观察到基线CXCL10与肿瘤缓解呈负相关(P=0.0033),且以60.95 pg/ml为截断值划分外周血高CXCL10组和低CXCL10组,发现高基线CXCL10与PFS不佳相关(HR=2.083,P=0.0483),考虑到CXCL10可促进肿瘤细胞生长、造成免疫抑制性微环境,基线CXCL10的高水平可能是免疫治疗疗效及预后不良的因素;后续该研究分析发现CXCL10水平的变化与疗效相关,亚组分析显示CXCL10水平在PR和SD亚组中升高,在PD亚组中降低,可能的机制是CXCL10水平是肿瘤抑制性免疫微环境的反映,因此免疫抑制患者可能更容易从免疫治疗中获益,但具体的机制后续还需进一步探索。Wu等[40]在一项研究中纳入67例免疫联合化疗治疗的NSCLC患者,分别测量基线(S0),治疗后4～6周(S1),治疗后10～12周(S2)的细胞因子水平,该研究也观察到在治疗有反应的患者外周血CXCL10的明显升高;后续该研究通过组合不同的细胞因子及细胞因子在不同时间点的变化幅度(S1/S0、S2/S0、S2/S1)等,发现CXCL10(S2/S0)/IL-8(S2/S0)作为新的标志物,对免疫联合化疗的NSCLC患者(n=67)免疫疗效及持久临床获益均有着较好的预测价值,这一结果也在其他多癌种队列(n=24)中得到验证,该研究创新性地展现了CXCL10衍生标志物的应用前景,值得进一步在大样本研究中进一步实践。

此外,IL-2,IL-5,IL-7,IL-10,IL-17,IL-18,TNF-α等相关因子也显示了临床预测效能(表1)。国内一项免疫单药或联合化疗的研究[41]纳入142例NSCLC患者,结果发现治疗2个周期后的低血清IL-10水平组(<12.9 pg/ml)及低IL-17水平组(<21.4 pg/ml)是临床获益(PFS≥6月)的独立影响因素。Wu等[40]在一项研究中纳入67例免疫联合化疗治疗的NSCLC患者,分别测量基线(S0),治疗后4～6周(S1),治疗后10～12周(S2)的细胞因子水平,发现S1时外周血高水平IL-2 与疗效正相关,S2时高水平IL-2与持久临床获益(PFS>180 d)相关;S1时高水平IL-7及IL-5与持久临床获益相关。Oyanagi等[31]研究发现基线低TNF-α与持久的临床获益(PFS≥6月)相关,尽管多因素回归分析未见统计学差异。Wang等[39]在研究发现基线IL-18水平与免疫治疗的疗效呈正相关(P=0.000 3),而与PFS无关,差异无统计学意义,但IL-18水平在免疫有效的患者中降低,在PD患者中降低。随着研究的深入,细胞因子作为一系列作用广泛的小分子蛋白质,其机制、临床价值将更进一步被挖掘从而指导临床实践。

表1 细胞因子在NSCLC免疫治疗的预测和预后作用相关研究

在ICIs治疗肿瘤的过程中,往往伴随着细胞因子表达和肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)细胞成分的变化[42],这些变化可较直接地反映ICIs作用及肿瘤负荷的变化情况。与传统的组织PD-L1表达及TMB等相比,治疗期间的TME中基因表达的变化往往更能反映免疫治疗的长期效果[43],作为免疫微环境中的主要免疫信号蛋白分子的细胞因子,可以进入血液循环,给临床带来了新的可能。外周血细胞因子作为免疫治疗标志物前景光明,其方便快捷,基本无创,并可重复采集、实时监测,与传统基于肿瘤组织的标志物相比可以克服肿瘤的时空异质性,且细胞因子的基线水平及治疗过程中的动态变化情况均可作为衡量NSCLC患者免疫疗效及预后的潜在标志物。但也要看到现阶段关于细胞因子的研究大多为回顾性研究或样本量较小的前瞻性研究,且细胞因子的检测方法、检测试剂、截断值的界定、检测时间点不统一等问题也给临床转化带来了一定的困难,未来大规模前瞻性研究进一步验证,以及统一的检测方法及界值的确定将为早日临床应用带来新的曙光。

目前,已有研究发现对于接受免疫联合化疗治疗的患者,IL-8和CXCL10联合(CXCL10/IL-8)作为预测因子的特异度和敏感度优于单独使用IL-8和CXCL10,相关结果不仅在肺癌,而且在多癌种患者的研究队列中得到了验证[40]。此外,细胞因子作为免疫相关不良反应的生物标志物的研究[44-47]也在广泛开展,并取得了初步的成果,未来期待细胞因子作为NSCLC免疫治疗的生物标志物在进一步指导临床诊疗,真正造福于广大肿瘤患者。

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