ω－ＡＣＴＸ－Ｈｖ１ａ与ＡｃＮＰＶ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎｅ基因的重组及重组融合蛋白的表达

摘要合成ω-ACTX-Hv1a基因，并与斜纹夜蛾多角体蛋白（AcNPV Polyhedrin）基因重组，构建重组蛋白表达载体并在大肠杆菌中表达融合蛋白。通过对温度、时间和IPTG诱导浓度等诱导条件的改变，以获得最佳诱导表达条件，所获得的最大量的融合蛋白经初步的纯化获得纯度为大约90%。获得ω-ACTX-Hv1a与polyhedrine基因的重组蛋白工程菌株，为此基因应用于杀虫剂奠定了基础。

关键词ω-ACTX-Hv1a；AcNPV polyhedrine；重组；表达

基于昆虫对传统化学杀虫剂的抗性、化学农药对环境损害的评价及杀虫剂对人类健康的影响所引起的关注，使得寻求新的控制害虫的方法更为迫切。ω-ACTX-1家族毒素对很大范围的昆虫具有致死性，包括鞘翅目、直翅目、鳞翅目和双翅目昆虫，如对棉花螟蛉、蟑螂、谷类的甲虫、大苍蝇和蝗虫都是致死的[1-3]。但是高剂量（2.5mg/kg）注射进入新生的小鼠显示是无害的[2]。毒素注射进入美国蟑螂（Periplaneta americana）导致其不能移动，肢翼高频率颤搐，而后瘫痪而死；将毒素直接应用于蟑螂后胸活动中心，使得其后腿没有反映，电生理学研究揭示了作用于昆虫而不是脊椎动物的系统发生特异性，是源于电控Ca2+通道（VGCC），ω-ACTX-Hv1 a是一个非脊椎电控钙通道的抑制剂[4]。多角体蛋白基因（Polh）是一个分子量大约为29kD的蛋白，保护病毒粒子免受物理和生化降解，并使得病毒粒子在宿主外保持感染活性。在病毒感染昆虫宿主的过程中，病毒DNA由多角体蛋白包裹。杆状病毒多角体蛋白作为融合伴侣在大肠杆菌中表达重组蛋白，显示了与野生型蛋白几乎完全一样的特性（在昆虫中肠碱性蛋白酶条件下快速的溶解），而且形成了易于分离的包涵体。研究者们后又用AcNPV的多角体蛋白与苏云金芽孢杆菌毒素蛋白融合构建了新一代的生物杀虫剂。结果显示此融合蛋白（约99kD，比在大肠杆菌中单独表达的毒素蛋白高3.6倍）以不可溶的包涵体形式在大肠杆菌中表达。融合蛋白对Plutella xylostella显示了很高的杀虫活性[5]。本文将多角体蛋白基ω-ACTX-Hv1a基因重组，并在大肠杆菌中表达，为新杀虫剂的研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒。克隆宿主菌E.coli DH5α及表达宿主菌E.coli BL21（DE3）均为本实验室保存，表达载体pET-30a及克隆载体PCR Blunt均购自大连宝生物公司。

1.1.2生化试剂。DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶和DNAMarker购自宝生物（大连）有限公司；IPTG购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Protein Marker购自宝生物（大连）有限公司；DNA回收试剂盒购自上海华舜工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1引物设计。

（1） ω-ACTX-Hv１a基因的合成引物设计：

（2） ACNPV Polyhedrin基因的合成引物设计：分别在5’和3’端引入NdeI和EcoRI内切酶酶切位点。

1.2.2ω-ACTX-Hv１a基因片段的获得。ω-ACTX-Hv1a昆虫毒素肽是从澳大利亚funnel-web蜘蛛分离而得，样品材料非常难得。因此，采用人工合成的办法来获得此基因。ω-ACTX-Hv1a基因的编码序列为37个氨基酸，即111bp。考虑到表达载体克隆，分别在该设计基因的5末端和3末端插入EcoRI 、XhoI 酶切点及其保护序列，共135bp。为了避免由于基因二级结构形成而导致的缺失，基因合成的技术路线采用分步合成二步法：先合成中间部分DNA片段再以合成的中间部分片段为模版，进行PCR反应，最后引入该基因的5末端和3末端DNA序列（图1）。

1.2.3ω-ACTX-Hv１a与AcNPV Polyhedrin基因的克隆及序列测定。ω-ACTX-Hv１a与AcNPV Polyhedrin基因的PCR产物分别与克隆载体PCR Blunt Vector用T4DNA连接酶4℃反应过夜。连接产物PCR Blunt-1a和PCR Blunt-ph用CaCl2法转化感受态细胞E.coli DH5α ，在转化平板上经kan（50mg/mL）蓝白斑初步筛选，然后挑白色菌落小量培养，提取质粒进行酶切鉴定，筛选得到的阳性克隆送由宝生物（大连）有限公司测序鉴定。

1.2.4表达载体的构建。对测序鉴定后的质粒PCR Blunt-ph用NdeI、EcoRI进行双酶切获得ph基因片段，连入用NdeI、EcoRI双酶切后的PET30a表达载体，构建PET30a-ph载体；再将PET30a-ph载体用EcoRI、XhoⅠ进行双酶切，用EcoRI、XhoⅠ进行双酶切的PCR Blunt-1a所获得的Hv１a片段连接，构建成表达载体PET30a-ph-1a。将构建好的表达载体用CaCl2法转入E.coli BL21（DE3），在转化平板上经kan（50mg/mL）蓝白斑初步筛选，然后挑白色菌落小量培养，进行序列鉴定。

1.2.5重组蛋白的诱导表达。取若干个经过序列鉴定的BL2（DE3）/pET-30a-ph-1a的新鲜菌落于5mL含50mg/mL kan的LB培养基中37℃振荡培养过夜；次日将菌液以5：100接种于10mL含50mg/mL kan的LB培养基中，37℃继续培养至A600约0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmoL/L，继续诱导4h后收集菌体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色。

1.2.6诱导条件的优化。对融合蛋白诱导表达条件进行探索，分别在不同温度（28℃、32℃、35℃、37℃、39℃）不同时间（1h、2h、3h、4h、5h）及不同的IPTG诱导浓度下（0.4mmoL/L、0.6mmoL/L、0.8mmoL/L、1.0mmoL/L、1.2mmoL/L）比较融合蛋白表达量哪一个更高，以确定最佳的表达条件。

1.2.7包涵体的纯化。收集诱导表达的菌体，将细胞悬浮于细胞超声波破碎缓冲液（50mmoL/LTris-Hcl pH 8.0；1mmoL/L EDTA）中，超声破碎，离心收集包涵体沉淀用包涵体洗涤缓冲液（50mmoL/L Tris-Hcl pH 8.0；2mmoL/L 尿素；0.15%Triton-x-100） 洗涤3次，获得的沉淀即为纯化的包涵体，取少量样品进行SDS-PAGE、考马斯亮蓝R-250染色。

2结果分析

2.1基因的获得与鉴定

2.1.1ω-ACTX-Hv１a基因的获得与鉴定。如图1所示合成ω-ACTX-Hv１a基因，并以H1F1、H1F2为引物进行PCR扩增，PCR扩增以及克隆载体的酶切鉴定结果见图2及图3。

从图2可以看出，通过PCR扩增到一条长约135bp的目标带，与实验拟扩增条带的大小一致；而从图3可知，克隆载体PCR Blunt-1a用EcoRI和XhoI双酶切得到的片段与插入的片段（约135bp）大小一致，初步证明克隆载体已构建成功，测序结果表明：所克隆到的1a基因与GenBank上公布的序列完全一致。

2.1.2ACNPV Polyhedrin基因的获得与鉴定。从图4可以看出，通过PCR扩增到一条长约750bp的目标带，与实验拟扩增条带的大小一致。而从图5可知，克隆载体PCR Blunt-Ph用NdeI和EcoRI双酶切得到的片段与我们插入的片段（约750bp）大小一致，初步证明克隆载体已构建成功。测序结果表明，所克隆到的polyhedrin基因与GenBank上公布的序列完全一致。

2.2表达载体的构建及工程菌的筛选

对测序鉴定后的质粒PCR Blunt-ph用NdeI、EcoRI进行双酶切获得ph基因片段，连入用NdeI、EcoRI双酶切后的PET30a表达载体，构建PET30a-ph载体；再将PET30a-ph载体用EcoRI、XhoⅠ进行双酶切与用EcoRI、XhoⅠ进行双酶切的PCR Blunt-1a所获得的Hv１a片段连接，构建成表达载体PET30a-ph-1a，酶切鉴定结果如图6、图7。

测序结果表明，所组建的表达载体DNA序列准确无误。

2.3重组蛋白的诱导表达及诱导条件的优化

SDS-PAGE电泳分析表达结果表明，诱导时间对该目的蛋白的表达量有一定影响。目的蛋白在诱导时间为4h左右表达量较高（图8）；诱导温度对该蛋白的表达量有一定影响，目的蛋白表达量在37℃左右为最大（图9）；而在所选定的IPTG浓度范围内目的蛋白的表达量没有什么大的差异（图10）。

2.4包涵体的纯化

取少量纯化包涵体样品进行SDS-PAGE、考马斯亮蓝R-250染色，结果如图11所示。经Uvi软件对图片进行光密度扫描得出纯化的包涵体纯度达到90%。

3讨论

化学杀虫剂能够稳定甚至增加农业产量，但是大规模无选择性地使用非特异性的产品（通常是对动物有毒的）会导致环境污染和非靶标生物的毁灭，也使抗性害虫得以发展。因此，自20世纪60年代以来，生物杀虫剂如昆虫病原

微生物、病毒甚至是线虫作为高效不破坏环境的替代物得到了相当的重视[6-7]。蜘蛛毒素是一个预先优化的组合的杀虫肽文库[8]。许多蜘蛛的毒液似乎都是杀虫化合物的丰富来源，因为它们最初的作用就是被用来杀死或者使被捕食的昆虫瘫痪的。而蜘蛛毒液作为1个含有一百多万不同的药理活性肽的整体，并未得到像蝎子等彻底地开发似乎是让人不可思议的。与大多数其他的属于蜘蛛类的节肢动物毒素的研究相比，ω-ACTX-Hv1家族毒素可能成为（生物）杀虫剂发展的先导源于它们对目前还没有成为任何可用的杀虫剂或杀螨剂靶标的离子通道的活性[9-10]。ω-ACTX-1 家族共有6个成员，ω-ACTX-1a -e之间只存在1~3个不同的氨基酸，而ω-ACTX-1f则与其他成员存在10个不同的残基[11]。这些肽，每个都含有36-37个残基，其中有6个严格保守的半胱氨酸残基，形成3个二硫键。每种蜘蛛可能含有6个或更多不同的毒素，而这种不同只是在于一个保守的残基被替代。将ω-ACTX-Hv1 a毒素基因与多角体蛋白重组，获得的重组蛋白在包涵体中表达，通过昆虫的消化，多角体蛋白在昆虫中肠碱性pH值环境中溶解，并被特定的碱性蛋白酶降解。将毒素蛋白释放，从而杀死昆虫。以大肠杆菌为宿主，低成本大量表达蛋白成为可能，并且这是一个基于蛋白的杀虫剂，改性活性生物living modified organism （LMO）问题（如环境和生态安全）就可以避免。

本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。

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