非小细胞肺癌组织中D2-40标记阳性淋巴管密度和E-钙黏蛋白的表达及其临床意义研究
【摘要】 目的:探讨D2-40标记阳性淋巴管密度（lymphatic vessel density，LVD）和E-钙黏蛋白（E-cadherin）在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)组织中的表达以及与临床病理特征的关系。 方法 用SP免疫组化染色法检测46例NSCLC组织标本及10例肺良性病变组织标本中D2-40和E-cadherin的表达，计数D2-40阳性淋巴管密度（LVD）。 结果 D2-40标记阳性LVD主要位于肿瘤边缘区，NSCLC组织中LVD明显高于良性病变组（p < 0.001），且与淋巴结转移密切相关（p < 0.001）。NSCLC组织中存在E-cadherin的低表达（与良性病变组相比，p = 0.001），E-cadherin的低表达与临床病理分期（p = 0.027）、肿瘤细胞低分化（p = 0.032）及淋巴结转移（p = 0.014）呈正相关，而与病理类型（p = 0.714）无明显相关。相关分析结果显示，NSCLC组织中D2-40标记阳性LVD增高与E-cadherin的低表达相关（t = 36.476，p < 0.001）。 结论 D2-40可以特异性识别NSCLC组织中淋巴管内皮细胞，其标记的淋巴管主要位于癌周组织。LVD和E-cadherin的低表达与NSCLC淋巴结转移密切相关，检测它们的表达可以预测肿瘤淋巴结转移。
【关键词】 非小细胞肺癌；E-钙黏蛋白；D2-40；淋巴管密度
【中国分类号】 R734.2【文献标识码】 A【文章编号】 1044-5511（2012）02-0042-02
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between lymphatic vessel density (LVD) marked by D2-40 and the expression of E-cadherin, and clinicopathological characteristics of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods Immunohistochemical SP method was used to detect the expression of D2-40 and E-cadherin in 46 archival surgical specimens of human NSCLC and 10 cases of benign pulmonary disease. The lymphatic vessel density (LVD) positively stained by D2-40 was observed and counted. Results The LVD mainly distributes in the tumor borderline. The LVD in NSCLC tissues was significant higher than that in the benign lesion（p < 0.001）and the LVD marked by D2-40 was significantly associated with lymph node metastasis（p = 0.014）. Reduced expression of E-cadherin was present in NSCLC tissues. The positive rate of expression of E-cadherin was negatively correlated with TNM stages（p = 0.027）, pathological grades（p = 0.032）, lymph node metastasis（p = 0.014）, and not significantly correlated with histology classification（p = 0.714）in NSCLC tissues. Correlation analysis showed that a highly LVD marked by D2-40 was correlated with decreased E-cadherin expression in NSCLC tissues（t = 36.476，p < 0.001）. Conclusion The new monoclonal antibody D2-40 can specifically recognize the lymphatic endothelial cells in NSCLC tissue. The lymphatic vessel marked by D2-40 mainly distributes in the tumor borderline. The relationship of LVD and reduced expression of E-cadherin with lymph node metastasis in NSCLC has been demonstrated. Detection of D2-40 and E-cadherin may be used as an indicator of lymph node metastasis in NSCLC.
【Key words】 non-small cell lung cancer; E-cadherin; D2-40; lymphatic vessel density
肺癌是世界各国最常见的恶性肿瘤之一，被公认为当今世界人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤，其发病率在多数国家仍在升高。肿瘤转移是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者的主要死亡原因，而淋巴转移是其中一个重要方面。D2-40是新近发现的淋巴管内皮细胞特异性标记抗体［1］，可用于标记组织中的淋巴管以观察淋巴管形态、分布并进行淋巴管密度（LVD）的计算，其敏感度高、特异性强，为研究NSCLC的淋巴转移提供了更为可靠的手段。E-钙黏蛋白（E-cadherin）是一种钙依赖性跨膜糖蛋白，几乎存在于所有正常的上皮细胞表面，为上皮细胞间黏附的重要分子。E-cadherin的黏附功能在几乎所有的人类上皮性肿瘤，包括乳腺、结肠、前列腺、胃、肝、食道、皮肤、肾和肺癌的发展过程中丢失［2］。本文通过选取46例NSCLC组织和10例正常肺组织进行D2-40和E-cadherin的免疫组织化学的研究，探讨D2-40标记LVD与E-cadherin的表达在NSCLC转移中的关系及其临床意义。
1． 材料和方法
1.1材料:(1)实验组 选取2002年1月 ~ 2008年12月我院行肺癌切除手术，经病理证实的46例NSCLC的存档蜡块标本。病人术前均未经化疗及放疗等治疗，其中男28例，女18例，年龄35~78岁，中位年龄59.5岁。依据1981年WHO制定的标准进行肺癌组织学分型，按1997年国际抗癌联盟（UICC）修订的标准进行TNM分期。组织学分型：鳞癌 17例，腺癌20例，腺鳞癌7例，大细胞癌2例；组织学分级：高分化 12 例，中分化 25 例，低分化及未分化9例；其中淋巴结转移阳性35例，阴性11例；TNM分期：I期10例，II期13例，III期23例，各类肺癌均无IV期病例。(2)对照组选取10例肺良性病变组织作为对照，其中肺大疱5例，肺外伤5例。
1.2方法:(1)试剂来源 D2-40抗体（1:50抗体编号MAB-0567）、E-cadherin抗体（1:50抗体编号MAB-0247）及SP抗体检测试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。(2)实验方法 标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，切片厚3μm，脱蜡水化，柠檬酸缓冲液高压修复，SP法免疫组化染色，DAB染色，苏木精对比染色，脱水透明，中性树胶封固。用已知阳性切片作阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判定:(1)D2-40标记LVD阳性计数 D2-40阳性：淋巴管内皮细胞的胞浆染成棕黄色，光镜下观察阳性淋巴管呈扩张状或闭塞条索状，管壁为单层扁平上皮，较薄，周围无明显的基底膜及平滑肌细胞，管腔中无红细胞（见图1）。LVD计数采用Weidner等（1992年）报道的方法，先在低倍镜下(×40)分别选取肿瘤边缘和肿瘤中心淋巴管高密度区，然后在高倍镜（×400）下分别计数被染色的淋巴管数目，每个染成棕色的内皮细胞或内皮细胞簇亦视为一个淋巴管，计数3～5个高倍视野下的淋巴管数目，取其平均值作为该例的LVD，单位（个）［3］。(2)E-cadherin的表达E-cadherin阳性产物分布于细胞膜上 ，为粗细一致的棕黄色颗粒。高倍镜下随机计数5个不同视野，每高倍视野计数100个瘤细胞，以阳性细胞占全部瘤细胞的百分比判断。无着色为（-），阳性细胞≤25%为（+），26%～75%为（++），≥76%为（+++）。将(-)～(+)归为reduced expression，将(++)～(+++)归为normal expression［4］ 。具体见图2、图3。
1.4 统计学方法:应用SPSS 16.0统计软件。计量资料以（X±S-）表示，采用单因素方差分析（one way anova）。率的比较采用x2 检验，D2-40标记阳性LVD数量与E-cadherin异常表达之间的关系用采用x2 检验。
2．结果
2.1 D2-40标记的良恶性肺淋组织巴管的形态特征、LMV分布及意义 D2-40定位于淋巴管内皮细胞胞浆或胞膜，为棕黄色颗粒。光镜下观察D2-40阳性的淋巴管壁为单层扁平上皮，无肌层管，管壁较薄，形态不规则，管腔中无红细胞，呈扩张状或闭塞条索状（见图1）。D2-40阳性的淋巴管多位于瘤周或肿瘤边缘，很少在瘤内。NSCLC组织中D2-40标记阳性的LVD数为21.8±4.1，对照组肺组织中D2-40标记阳性的LVD数为13.8±2.4，两者差异有统计学意义（p < 0.001）。NSCLC组织中有淋巴结转移组LVD 为22.7±3.6，无淋巴结转移组LVD为18.0± 2.3，两者差异有统计学意义（p < 0.001），具体见表1。
2.2 E-cadherin的表达:E-cadherin在NSCLC组织中染色明显减弱或不着色，其阳性率与对照组肺组织中的表达阳性率有显著性差异（p < 0.001）。E-cadherin的低表达与临床病理分期（p = 0.027）、肿瘤细胞低分化（p = 0.032）以及淋巴结转移（p = 0.014）呈正相关，而与病理类型（p = 0.714）无明显相关（见表2）。
2.3NSCLC组织中D2-40标记阳性的LVD与E-cadherin表达的相关性 相关分析结果显示，NSCLC组织中D2-40标记阳性LVD增高与E-cadherin的低表达相关（t = 36.476，p < 0.001），具体见表1。
3．讨论
D2-40是近年发现的一种单克隆抗体，可与癌胚抗原M2A特异性结合，M2A表达于淋巴管内皮细胞而不表达于血管内皮，被认为是最具有特异性的淋巴管标记物，目前被广泛用于肿瘤淋巴管与肿瘤生物学关系的研究［5］。本研究亦显示D2-40在薄壁淋巴管结构的内皮细胞呈阳性表达，邻近充满红细胞的血管则呈阴性表达。同时在本研究中，D2-40阳性淋巴管多位于瘤周或肿瘤边缘，很少在瘤内。这表明NSCLC瘤内缺少淋巴管生成，可能是由于瘤内淋巴管生成因子的缺乏或淋巴管抑制因子的出现，亦可能是大块肿瘤体产生的静水压可使肿瘤内产生的任何淋巴管被压扁而没有功能所致［6］。NSCLC组织中D2-40显示的LVD平均值高于对照组肺组织，差异有显著性（p < 0.001）；有淋巴结转移组LVD较无淋巴结转移组升高，差异有显著性（p < 0.001）。上述结果提示淋巴管生成在肿瘤淋巴结转移中具有重要作用。D2-40标记阳性的LVD是NSCLC淋巴转移的重要影响因素，LVD的增加有利于NSCLC淋巴转移的发生。
E-cadherin是一种钙依赖性的具有细胞和细胞黏附特征的跨膜糖蛋白，具有钙依赖性的同型细胞黏附作用，在维持组织结构的完整性和极性以及细胞分化等方面有重要作用。E-cadherin表达率的降低使肿瘤细胞间正常黏附、连接作用减弱，更易从癌巢中脱落，增强了肿瘤细胞的侵袭力，为肿瘤的转移提供了基础，E-cadherin黏附功能的丧失是细胞获得去分化和高侵袭性的关键。本研究中，E-cadherin在NSCLC组织中的阳性表达率显著低于对照组肺组织，提示肿瘤组织存在明显的E-cadherin下调或缺失，但是各组织学分型之间无明显差异。进一步对E-cadherin表达水平与NSCLC的进展、转移的研究发现，E-cadherin表达与组织学分级呈正相关，组织学分化差，E-cadherin表达水平呈下调或缺失。在TNM分期上，分期越晚的患者，其E-cadherin阳性表达率越下降明显。在淋巴结转移方面，阳性组病例E-cadherin表达水平远远低于无淋巴结转移的阴性组。本研究表明E-cadherin的下调或缺失和NSCLC的进展、转移密切相关。
E-cadherin作为细胞黏附因子，其表达下降或缺失可促使癌细胞脱落，而相应癌周组织内淋巴管增多则增加了癌细胞与淋巴管接触的面积。并且，新生的淋巴管仅由单层细胞构成，无基底层，细胞间紧密连接少，同时肿瘤组织间质液压通常增高，使连接淋巴管内皮细胞和周围结缔组织组织的锚丝的张力增加，造成内皮细胞间的开放连续增多、间隙增大，使淋巴管抵御肿瘤侵入的能力非常弱，为肿瘤细胞的转移提供了有利的通道，从而更有可能发生淋巴结及远距离转移，加速NSCLC病程的进展。D2-40标记LVD与E-cadherin，这两者在NSCLC浸润转移过程中相辅相成。通过对这两者之间的研究，将有助于我们进一步了解肿瘤淋巴转移的机制及过程，从而找到抑制肿瘤淋巴转移的靶点或预测肿瘤患者预后的指标，为肿瘤生物治疗提供依据。
Figure 1. Immunohistochemical staining of some D2-40-positive lymphatic vessels are present at the tumor periphery.
Figure2. Squamous cell carcinoma of the lung with reduced E-cadherin expression（+）(Immunohistochemical SP ×400)
Figure3. Pulmonary adenocarcinoma with reduced E-cadherin expression（+）(Immunohistochemical SP ×400)
Table 1. LVD marked by D2-40 in the patients eolled in the study and the correlation with expression of E-cadherin
Table 2. The expression of E-cadherin in the patients eolled in the study and the clinicopathologic characteristics of NSCLC
参考文献
［1］ Kahn H J, Marks A.A new monoclonal antibody, D2-40, for detection of lymphatic invasion in primary tumors ［J］. Lab Invest, 2002, 82 (9) 1225-57.
［2］ Hirohashi S. Inactivation of the E-cadherin-medaated cell adhesion system in human cancers［J］. AM J Pathol, 1998, 153: 333-9.
［3］ WEIDNER N. Tumor angiogenesis: review of current applications in tumor prognostication ［J］. Semin Diagn Pathol, 1993, 10(4):302-13.
［4］ 韩安家，熊敏，李智等。上皮钙依赖粘附素相关分子在乳腺浸润性小叶癌和导管癌中的表达及意义。中华病理学杂志，2001, (30): 27-30.
［5］ KAHN HJ, BAILEY D, MARKS A. Monoclonal antibody D2-40, a new marker of lymphatic endothelium, reacts with Kaposi"s sarcoma and a subset of anglosarcomas［J］. Mod Pathol, 2002, 15(4): 434-40.
［6］ Vleugel MM, Bos R, van der Groep P, et al. Lack of lymphangiogenesis during braest carcinogenesis［J］. J Clin Pathol, 2004, 57(7): 746.